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1 不同类型铅中毒大鼠模型的神经系统毒性学习记忆障碍机制比较研究 摘要 大量的流行病学调查和研究表明铅中毒可诱发肾脏、神经系统、造血系统损伤特别是对脑发育的影响备受关注大家公认为发育大脑更容易受到铅的损害国内外有许多关于铅中毒对脑发育影响机制研究但其物质基础如何仍未完全明确。铅中毒对成熟大脑影响的报道相对较少有关铅中毒对发育大脑和成熟大脑影响的机制差异并没有系统报道。本次实验采用幼年和成年的大鼠以腹腔注射和自由饮用醋酸铅溶液的方式给药分别选用幼年和成年大鼠分别建立了急性和慢性铅中毒模型造模成功后进行水迷宫实验了解大鼠的记忆和识别能力处死大鼠后采用病理和免疫组化方法研究不同类型铅中毒大鼠中枢神经系统的神经元、星状胶质细胞的生长情况了解神经元环路的变化情况。采用原子吸收测定、生化试剂测定、酶联免疫法方法和分子生物学技术研究中枢神经系统的氧化和抗氧化防御系统了解活性氧的产生情况和氧化应急的损伤情况同时分析脑组织中钙离子代谢、多种激酶的活性及主要神经递质和信号分子的变化情况了解铅中毒对大脑内的代谢和信息传递的影响。通过一系列实验对不同类型铅中毒大鼠的行为学解剖组织学、代谢学和信息学等多方面比较寻找两种大鼠铅中毒模型的差异进行有关指标的进一步研究寻找可能的新机制为铅对中枢神经系统的毒性机制进一步研究提供理论支持同时为排铅药物筛选研究提供实验基础。 铅中毒大鼠大脑中枢神经系统。 2 不同类型铅中毒大鼠模型的神经系统毒性学习记忆障碍机制比较研究 一、项目可行性报告 一立项的背景和意义 铅对环境的污染日益加剧已由职业环境扩展到日常环境.实际上随着我国的社会经济发展特别是汽车保有量和房屋装修业的迅速增加每个城市都面临环境中的铅负荷不断上升的危险而铅可通过皮肤、呼吸道、消化道进入人体诱发肾脏、神经系统、造血系统损伤1。1999年8月全国部分地区和城市儿童血铅水平调查平均38.8的儿童血铅水平超过100 gdL-1。也就是说我国城市儿童中有约40左右受到铅中毒的威胁2。近年人们生活条件提高了但铅中毒事件任然严重国内外常常报道铅超标或中毒的事件34美国、加拿大等均报道交通警察血铅超标严重4。浙江省近年不同地方报道中毒的事件 2005年浙江中部的东阳、兰溪、永康、义乌、浦江、绍兴等市县的锡箔产业的大量从业人员和上千名儿童发生铅中毒事件2011年在浙江台州和德清的电池生产厂引起周围数百位居民铅中毒事件。 由此可见铅中毒已经是比较严重的社会问题探索铅中毒的毒性机理研究防治措施和筛选相关药物有非常重要的现实意义。在铅中毒对人体的危害方面研究发现5-6铅能引起贫血脑发育、肝、肾功能损害降低免疫功能致癌等作用。其中对脑的影响最为严重由于脑是铅最敏感的器官微量铅即可引起神经系统的功能障碍严重中毒可引起中枢神经细胞退行性改变导致脑病儿童可导致智力低下认知缺陷5因此铅中毒的很多深入研究是关于脑部的毒性损害。 铅对脑的损害集中在一些特殊的区城。最首要的部位包括大脑皮质的额前区海马回和小脑。这些区域的神经元如颗粒细胞和小球周细胞等主要参与学习记忆而在这些区域的胆碱能系统中重要的神经环路如隔-海马、斜角带-嗅球、Meynert基底核NBM-新皮层等具有维持正常的学习记忆功能7-8。星状胶质细 3 胞参与维持正常的学习记忆功能9。铅中毒的一些特征性的临床表现有可能正是与这种特殊的解剖部位的特点密切相关。如大脑皮质额前区的损伤可以引起认知功能的损害并可引起进行性的注意力分散10。 大量研究显示11铅引起氧化应急损伤一方面铅作为氧自由基的启动剂而诱发氧自由基的产生铅通过线粒体产生活性氧同时还可抑制氧自由基的清除酶SODCAT活力使血肝和脑中MDA含量增高。另一方面铅作为琉基的亲合物质易于与含疏基的酶GSHPxG6PDGR或物质GSH结合而使相应酶活力下降和琉基耗竭因此使机体的抗氧化能力下降进一步增强脂质过氧化的毒理效应。Yiin和Lin等人的研究证明12铅能显著增加油酸亚油酸和花生四烯酸中MDA的含量且脂肪酸中双键数目越高其相应体系中MDA含量也越高。铅能诱导花生四烯酸的聚集从而增加细胞膜脂质过氧化的敏感性13。铅在体外能与磷脂双分子膜紧密结合14。体内实验也证明15脂质过氧化水平的增加和磷脂水平的下降与脑区的铅浓度显著相关。因此转变的膜脂质成分可导致细胞膜完整性渗透能力的变化使细胞质膜结构受损细胞内的线粒体和内质网释放凋亡相关物质促进细胞凋亡。 铅可取代钙的作用影响细胞内多种激酶的活性等多个环节铅可以通过与钙离子竞争进入细胞内干预突触前终端钙离子而对LTP起作用16。还可作用于突触后膜上电压依赖性的钙离子通道阻断钙离子电流6铅可以激活蛋白激酶CPKC系统引起细胞内游离钙浓度的升高而胞内钙离子超载是神经细胞损伤死亡的重要原因。铅还作用于钙调素-蛋白激酶和cAMP-蛋白激酶等使钙调蛋白依赖性蛋白激酶CaMK失活517减少ERK2活性维持时间降低ERK2通过调节细胞骨架蛋白、核蛋白和信号蛋白等发挥其对突触可塑性的调节和学习记忆的形成。铅还可以通过抑制腺苷酸环化酶间接抑制蛋白酶磷酸化过程从而影响学习记忆过程18。铅可以破坏星形胶质细跑19。另外的几项研究表明 2021铅模拟钙样作用激活NMDA受体复合物、活化NOS引发自由基气体分子NO合成增加及自由基连锁反应导致组织细胞的变性与坏死同时NMDA受体复合物的激活与N0对sGC的活化引起胞内cAMP水平升高进而刺激突触前膜兴奋性氨基酸释放异常导致神经兴奋与传导异常表现出神经行为异常。 总之有关铅对脑损伤机制方面国内外学者目前已经达成广泛的共识5-6 4 铅通过诱发细胞内过氧化物含量升高破坏细胞的结构通过影响钙离子代谢、细胞内多种激酶的活性等多个环节影响脑内少突胶质细胞和星状细胞的正常功能并诱导神经元凋亡的过度表达。 这个机制解释了许多铅致脑损伤的毒理原理但仍有一些机理任未明确如神经环路受损便出现严重的学习记忆障碍的问题虽然国内外学者普遍认为铅中毒可引起严重的认知障碍但这种神经行为障碍是否与基底前脑胆碱能系统异常有关仍未明确。针对目前很多铅中毒研究主要集中在发育脑对成熟脑研究比较少且一些铅中毒的作用机制不明的情况下本研究采用系统研究法通过选用幼年和成年大鼠分别建立急性和慢性铅中毒模型22测定铅中毒大鼠学习记忆能力同时观察铅对大鼠脑神经发生、基底前脑成熟胆碱能神经元及星形胶质细胞的毒性效应另外分析引起铅中毒的主要机制涉及的指标在不同模型动物的表现发现铅对不同生长时期的脑损伤差异寻找差异产生的可能原因进行有关指标的进一步研究寻找可能的新机制为铅神经毒性机制的进一步研究积累实验基础。 参考文献 1Ji A Wang F Luo W Tang R Chen J Cai T. Lead poisoning in China: a nightmare fromindustrialisation. Lancet 2011 377: 147476. 2Shen XMet al. Childhood lead poidoning china A International Symon childhood lead pos prevShanghai China:19968-18 3尹平平. 血铅超标的警钟还要敲响多少次 环境保护2011124 4East Afr J Public Health. Environmental pollution of lead in traffic air and blood of traffic policemen in Khartoum State Sudan.2011 Jun82:138-40. 5Olympio KPK Gon?alves C Gnther WMR Bechara EJH. Neurotoxicity and aggressiveness triggered by low-level lead in children: a review. Pan Am J Public Health. 2009263:26675. 6 Talia Sanders1 Yiming Liu1 Virginia Buchner2 and Paul B. Tchounwou1 Neurotoxic Effects and Biomarkers of Lead Exposure: A Review Rev Environ Health. 2009 241: 1545. 7王来栓邵肖梅.中枢胆碱能神经系统功能的研究进展.国外医学2004l26:457-45 8 Mesulam MMMufson EJWainer BHet al.Central cholinergic pathways in the rat:an overview based on an alternative nomenclature ch1-ch6. Neuroscience 198310 4 :1185-1201. 9Katoh-Semba R Asano T Ueda H et al.Riluzole enhances expression of brain-derived neurotrophic factor with consequent proliferation of granule precursor cells in the rat hippocampus.FASEB J20021610:1328-1330. 5 10AltmannHLH Wiegand. Acute lead exposure transiently inhibit shippoeampal neuronal activities in vitroBrains.1988455:254ee261。 11Hande GNuran E.Can antioxidants is beneficial in the treatment of lead poisoning Free Radieal Biology amp Medicine20002910:927-945 11Shafiq-ur-Rehmans Abdulla.M. Impacted lead on phospholipid metabolism in humanErythrocyte membranes.Bull.J toxicol Occup.Enviren Health. 19932:35. 12Yiin SJ Lin TH. Lead-catalyzed peroxidation of essential unsaturated fatty acid. Biol Trace Elem Res. 199550:167-172. 13Lawton.L.JDonaldson.W.E. Lead-indueed tissue fatty acid alterationst and lipid peroxidation.Biol Trace Elem Res199128:83一97. 14Hoogeveen JT. 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Neuro Pharmacol1995347:723. 22雷洁古桂雄马如娅.新生大鼠铅损伤动物模型的建立实验动物科学与管理200320 1:8-10 二国内外研究现状和发展趋势 铅对环境的污染日益加剧铅中毒已经是比较严重的社会问题探索铅中毒的毒性机理对研究防治措施和筛选相关药物有非常重要的现实意义。虽然国内外学者普遍认为铅中毒可引起严重的认知障碍但这种神经行为障碍是否与基底前脑胆碱能系统异常有关仍未明确。针对目前很多铅中毒研究主要集中在发育脑对成熟脑研究比较少且一些铅中毒的作用机制不明的情况下本研究采用系统研究法通过选用幼年和成年大鼠分别建立急性和慢性铅中毒模型22测定铅中毒大鼠学习记忆能力同时观察铅对大鼠脑神经发生、基底前脑成熟胆碱能 6 神经元及星形胶质细胞的毒性效应另外分析引起铅中毒的主要机制涉及的指标在不同模型动物的表现发现铅对不同生长时期的脑损伤差异寻找差异产生的可能原因进行有关指标的进一步研究寻找可能的新机制为铅神经毒性机制的进一步研究积累实验基础。 三项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点 研究内容 1 不同类型铅中毒大鼠模型建立 1 急性铅中毒模型。 A 幼年急性铅中毒大鼠模型建立。幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天 采用腹腔注射醋酸铅溶液根据血铅浓度变化确定急性铅损伤动物模型建立 B 成年急性铅中毒大鼠模型建立。选用成年大鼠 采用腹腔注射醋酸铅溶液根据血铅浓度变化确定急性铅损伤动物模型建立 2 慢性铅中毒模型。 A幼年急性铅中毒大鼠模型建立。幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天 采用自由饮用醋酸铅水溶液根据血铅浓度确定慢性铅损伤动物模型建立 B成年急性铅中毒大鼠模型建立。选用成年大鼠 采用自由饮用醋酸铅水溶液根据血铅浓度确定慢性铅损伤动物模型建立 2 行为学实验Morris水迷宫实验 1采用定位航行实验测定大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。 2空间收索实验测定大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力。 3组织学实验 组织病理实验。取材大脑皮质的额前区海马回和小脑进行肉眼形态观察和病理切片观察同时进行免疫组织化学分析了解神经干细组织病理实验胞分化为星形胶质细胞或神经元的趋势和状态和新增殖细胞和胆碱能神经元的趋势和状态。 7 4生化、酶联免疫法和分子生物学实验 采用试剂盒、原子吸收仪和PCR仪测定各组大鼠脑匀浆中相关离子神经递质信号分子以及相关酶的含量和活力了解氧化应激损伤机制钙离子代谢机制主要激酶代谢变化情况。 通过对以上实验结果的数据分析寻找发育大脑与成熟大脑在铅中毒中的差异性急性和慢性铅中毒的差异性为铅对中枢神经系统的毒性机制进一步研究积累基础数据为提供理论支持同时为排铅药物筛选研究提供实验基础。 拟解决的问题 1. 幼年大鼠和成年大鼠的给药剂量选择急性铅中毒和慢性铅中毒的时程选择。找出最佳建模方式。 2. 了解与学习记忆相关的大脑皮质的额前区海马回和小脑等组织在铅中毒后的变化情况从形态、组织病理到免疫组化为铅中毒的后期机制变化寻找物质基础。 3. 比较中枢神经系统铅中毒机制中主要相关代谢和信号通路的差异结合行为学和组织学情况全面了解中枢神经系统铅中毒机制寻找引起差异的可能机制。 主要创新点 1. 比较不同大鼠铅中毒模型的特点为不同实验要求提供合适动物模型。 2.结合不同层面行为学、组织学、代谢和信息学的改变分析了不同类型铅中毒大鼠中枢神经系统变化情况寻找其差异了解差异的可能原因发现可能的新机制为铅中毒防治提供理论支持。 四项目预期目标主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况 通过本项目实施预期达到以下目标 1.成功建立大鼠不同类型铅中毒模型 8 2.在国内外重要期刊发表论文2-3篇 3.系统比较大鼠不同类型铅中毒模型的中枢神经系统变化异同为深入开展铅中毒机制研究通过实验数据。 五项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解 项目实施方案 1不同类型铅中毒大鼠模型建立 1 急性铅中毒模型。 A、 幼年急性铅中毒大鼠模型建立。幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天 采用腹腔注射醋酸铅溶液0.36 、0.12 醋酸铅溶液0.1mL 隔日注射1 次共8 次至17d 时实验结束。根据血铅浓度变化确定急性铅损伤动物模型建立 B、成年急性铅中毒大鼠模型建立。选用成年大鼠200-300 g 采用腹腔注射醋酸铅溶液0.36 、0.12 醋酸铅溶液0.1mL 隔日注射1 次共8 次至17d 时实验结束。根据血铅浓度变化确定急性铅损伤动物模型建立 2 慢性铅中毒模型。 A、幼年急性铅中毒大鼠模型建立。幼年铅中毒大鼠模型选用新生大鼠出生当天 采用自由饮用醋酸铅水溶液醋酸铅溶液浓度为2、0.2、0.05 gL醋酸铅水溶液。染毒60-90天根据血铅浓度确定慢性性铅损伤动物模型建立 B、成年急性铅中毒大鼠模型建立。选用成年大鼠200-300 g 采用自由饮用醋酸铅水溶液醋酸铅溶液浓度为2、0.2、0.05 gL醋酸铅水溶液。染毒60-90天根据血铅浓度确定慢性性铅损伤动物模型建立 2行为学实验Morris水迷宫实验 1采用定位航行实验实验历时4天半每天分上、下午两个时间段共9个时间段大鼠每时间段测试4次分别从水池的东、南、西、北4个点入水入水时大鼠面朝池壁。设定120秒为最长逃避潜伏期escape latency超过120秒的记录为120秒。每只大鼠在120秒内仍未能找到平台则由实验者将其 引向平台时间则记为120秒每次测试间隔为15秒。测试结果记录大鼠寻找平台的逃避潜伏期、运动路程和运动速度。 9 2空间探索试验。测试第五天下午将平台移去将大鼠固定一点放入水中120秒记录它在120秒内穿过平台位置的次数穿环次数。 3组织学实验 取材大脑皮质的额前区海马回和小脑进行肉眼形态观察看有无异常。进行病理切片进行常规染色观察脑细胞及周围组织变化情况同时进行免疫组织化学分析ChAT、BrdU、NF、GFAP单标或双标反应切片观察中枢神经元和胶质细胞的存在状态和新增殖趋势和状态。 4生化、酶联免疫法和分子生物学实验。 采用原子吸收仪测定血铅含量生化试剂盒测定NO、GTP、谷氨酸、谷胱甘肽 、钙含量SODMDA GSH-Px AChE活性。ELISA测定钙调素、蛋白激酶和cAMp、腺昔酸环化酶鸟昔酸环化酶磷酸二酯酶NOS和CaMK活力 PCR仪测定cNOS和CaMKmRNA表达情况。 技术路线 10 六计划进度安排。 2012年7月2013年3月大鼠铅中毒模型的建立与验证。 2013年3月2013年12月 行为学实验Morris水迷宫实验组织病理实验。免疫组织化学分析星形胶质细胞或神经元的状态。生化、酶联免疫法和分子生物学实验。通过测定血液和脑组织铅含量及生化指标了解各种动物的铅含量状况酶法及酶联免疫方法测定脑组织中主要代谢酶的活性酶联免疫法测定相关蛋白的表达状况RT-PCR测