（作物遗传育种专业论文）水稻抗白叶枯病基因Xa23的分子标记定位及基因组文库构建.pdf

摘要 水稻抗白叶枯病基因妇刀是从我国普通野生稻 捏研 厅p a 鲫 中鉴定出来的优良基 因 对国内外鉴别菌系表现为高抗 完全显性和全生育期抗病 为了克隆肠刀基因 本实验 室构建了含2 5 6 2 个单株的f 作图群体 并将肠三 定位在水稻第l l 染色体长臂上 本文针对船船基因的进一步分子定位和克隆 开展了系列研究 取得了主要结果如下 1 选取第l l 染色体长臂g 2 5 7 至g 1 4 6 5 区间的1 5 个r f l p 探针进行亲本问多态性分析 共6 个标记在亲本之间存在多态性 其中探针c 1 0 0 3 a 距怕三 基因最近 两者间遗传图距为 0 4 c m 2 由于分子标记辅助选择育种的需要 将标记c l 0 0 3 a 转化为s t s 标记s t s 0 3 为育种学 家提供稳定 方便的分子标记 3 以c b b 2 3 黄化苗为材料 以p y l t a c 6 8 腿为载体 构建了t a c 基因组文库 该文库由 6 8 7 3 6 个克隆构成 插入片段平均大小为3 2 k b 约覆盖水稻基因组5 1 倍 4 根据国际水稻基因组测序计划公布的水稻日本晴第1 l 染色体长臂上的测序结果 本研 究以c 1 0 0 3 a 序列和脚2 0 6 引物信息进行b l a s t 比对 建立了跨妇刀基因等位位点的跨叠克隆 群 以跨叠克隆群序列设计特异引物3 l 对 经p c r 扩增获得了更紧密连锁的标记a 8 9 a 2 a l 6 0 1 c f 2 0 和a 8 3 b 4 其中a 8 9 a 2 和a k 6 0 1 与c 1 0 0 3 a 均位于屁刀的近着丝粒一侧 而c f 2 0 和a 8 3 b 4 位于另一侧 这些标记距屁刀基因的遗传距离分别为0 4 0 2 0 2 和0 4 c m 5 利用i r 2 4 和c b b 2 3 杂交构建的共1 0 7 6 个单株的f z 群体 菌系p 6 鉴定表明 f z 群体的 抗感反应非常清晰 将标记s t s 0 3 和a 8 3 b 4 进行全部n 植株的检测 表明将肠刀定位于标记 s t s 0 3 和a 8 3 b 4 之间是正确的 由于j g 3 0 和i r 2 4 有着不同的遗传背景 筛选了在j g 3 0 c b b 2 3 之间没有多态性的引物 又获得了4 个更紧密连锁的标记 分别是a 8 a a 8 c c f 6 l j 4 7 8 将在标记s t s 0 3 和a 8 3 b 4 之间发生交换的f z 植株种植其n 代家系 接种鉴定表明r 代群体的 抗 感分离比例完全符合预期值 结合j g 3 0 c 船2 3 群体的定位结果 将肠刀定位于标记a l 6 0 1 和c f 2 0 之间 6 将b a c 克隆6 0 8 用妇曲ai 内切酶不完全消化连接到表达载体p c a 船i a l 3 0 和 p 1 l t a c 7 4 7 h b 构建了两套亚克隆文库 分别挑取了重组子3 9 6 个和2 0 0 个 其插入外源片段 大小分别为为6 1 2 k b 和1 0 2 5 k b 7 使用r i c e g 从s 软件对阳性b a c 克隆序列进行基因预测 确定0 r f 4 5 6 7 和8 是候 选基因 筛选p c a i 毋i a 亚克隆文库 获得了分别包含有o r f 4 5 7 和8 完整序列的表达载体 克隆 其中0 r f 6 编码区较大 没有获得包含完整序列的克隆 经农杆菌遗传转化共获得了转 0 r f 4 5 7 和8 的共1 1 8 0 株的转基因植株 经菌系p 6 接种鉴定表明这些转基因植株均没有 抗性 8 使用r n a i 载体p c k 3 0 3 构建了候选基因的7 个r n a i 载体 将不同0 r f 的r n a i 载体遗 传转化到携有肠船的粳稻中野1 9 号和籼稻c b b 2 3 目前已经获得了转r n a i 植株 有待于进 一步接种鉴定 关键词 水稻白叶枯病 儿船 分子标记 基因组 文库 遗传转化 a b s t l a c t n er i c eb t e l 谢b l i g h t b b 托s i s t a n c eg e n e 石力3 w 豁 蛐a l yi d 伽曲e d 触n 功声口 咖q g 册b a s e do nt h e 托s i s t a 玎睇s p e c m l l i le v a l 删o n f 髂i 咖c e 咖p e 鼬di i l i 蜘 切l i 粕a l y s i s ni sa c 伽p l e t ed o m i l l a n tm s i g t a n c eg e n ew i mt h ew i d e s tf e s i s t a s p 代觚珊a m o n ga ut h ek n o w nb b r e s i s 扭n g e si d e n n 舶ds o 缸t 0c l o m 朐打g 蚰e af 2 州m l m i 姐眦l u d 崦2 5 6 2p l 蛆t sw c 彻s 姗c i e d 肋map a i r0 f n 髑p i s o g i cl 缸ej g 3 n c b b 2 3a n d 五口 啪s 脚m 鲥l ym a p p e d 彻t b e 衄g 彻o f r i c ec h r o m o s 咖e1 1 t h i sf e s e a r c hi sa i l n i n ga tf i n em a p p m g 锄dc l o n 血1 9o f 丑妇 柚dt i l ef o l l d w i n g 蚰n s b a v eb e e n o b 妇缸e d 1 l p 妣a l y s i sw 粥p e 晌r m e dw i 血1 5p f o b c sl o c 砒e dw j n i i nt l i er e g i b c 抑e g 2 5 7 锄dg 1 4 6 5 t h el g 枷o fr i c ec h r o m 船啪e1 1 s i p m b c ss h o w 州y m o r p h i 锄k m e 胁j g 3 0 鲫dc b b 2 3 彻d 撕o n g o f 也锄 c 1 0 0 3 a i sc l 傩e l y l i n k e d w 沛肠刀柚d 血c g c n 甜c d i s 埘i i s 0 4 c m 2 n er f l pm 啦e rc l 0 0 3 aw 粘们m s f o 咖e d 证t 0s 唧船c 盹g g s 妇 s t s m a f l w h i c hc 粕b e e 粥n y 印p l 湖f b rm o l e c u l 盯m a r k e h s s i 种e d l c t i 叽0 俄s o f 石昭3m 咄埠b f d 血gp r o g 眦s 3 at a cg 蛐伽i cl i b 俺r yo f c 髓2 3h b o r i n g 脚g ew 私c 咄咖c t e dm 咄t a cb i n a r yv e 咖 p 肌 c 6 8 蛐 t h el i b r a r yc 叩s i 啦o f6 8 7 3 6 如d i v i 如a lc l 髂 1 1 i ea v e 随g ej n s 叭s i 黔i s3 2 k b 髓e g 咄ec o v e m g eo f t h et a cl i b 托l yw 鹊a t 唧t5 1h a p l o i dg 锄砌ee q u i v a l e n t so f r i c e 4 t k 咖l 魄o fi g 雠嘶cl o c 璐o f 石妇j b a s e d 仰n i p p b a 托 q 1 1 c e w 鹞o s 仃l 哪e db yb l a s t w j t bc 0 0 3 as e q u 曲c e 枷d 劬n o f s s rm 疵盯胁1 2 雌n 呻 0 n op a 缸0 f 辨i a l 砷n w 哪 d e s i g d e db 撼e d 血ec 衄t i gs e q u 锄c e 锄d 岫e df 研蛐p n l y i l l g 缸g m 锄tl 即g i l ip b m l o r p h i s mb c t w e 蛐 j g 3 0 锄dc b b 2 3 f o 呲m a m 粥 a s 嫩 a k 6 0 1 c f 2 0 锄da 8 3 b 4 w e 托曲v e l o p c d l i n a g e 柚a l y s i s s b 删e dt h 砒a 8 9 a 2 柚da k 6 0 lw 够k 址酣 舭s 锄es i d e 勰c 1 0 0 3 a w i 血g 咄6 cm 咖i c e st o 脚3 o f 0 4 c m 柚do 2 c m s p e 嘶v e 垮 c f 2 0 锄da 8 3 b 4w e 糟l o c a t e d 砌e rs i d eo f m 口j w i 血g 朗甜c d i s t a n c o f o 2 c m d0 3 c m m s p e c t i v e 啊 5 a n o l h 盯f 2 脚l d 鲥o nw 妯1 0 7 6 m d i v j d i l a l sd e f i v c d 的mt l i ec 璐o fi r 2 4 c b b 2 3w a sc 伽曲懈d t h es e g 挥g 鲥 o f r e s i s 咖na n ds u e p d b l ep l a n 忸i n 山ef 2p 叩 l l 融i 伽a 掣训w 曲a3 1 枷oa c c 蛐g t o t h e n a c t i t or e60 f j 幻柚d t h ef 2p 叩札1 a t i 蚰w 私邳p p r i 砒c f b r m a p p i i l g 五h 2 3g e n i s c 删倚m e dt h 醚魁田w 船l o c 砷酣k t w 嘲蝴哦c r ss 髑0 3 锄da 8 3 b 4b ye x 锄妇n ga n 吐悖i n d i d i i a l so f t l l ep o p 旺l 砒i w 血s t s 0 3a n da 8 3 b 4 b e 渊l j g 3 0b a d i 匿咖tg 硝cb k 咖dw 也邛巳2 4 州m s h o w 吣 p o 帅 p h i 酶w e j g 3 0a n dc 髓2 3w m 鼬t i i 口 a l y z e d 衙刚y m o r p h i b e t w 啪m 2 4a n dc b b 2 3 f 伽rc l o s 盯m a r k m a 8 a a 8 c c f 6 神dl j 4 7 8 w e d e v c l o p e d 锄dn o c 伽b i n a n t sw e 代f 曲n dk t v e 也em a d 呵s 锄d 爿砬 g 如e rp 叩u l 缸i s 龀粕f 2r e c 伽b i n 蛐协 b 嘶 e s t s 0 3 锄da 8 3 b 4w e t e 妯 u l a t e d 州出f ep 60 f 肋 柚dm e g r e g 砒i 咂o f 蚰s c c p 曲l e 柚d r e s i s t a l l tp 1 t 她 dw i 也叩c t e d 例曲 6 1 o 出l el i b r a r i e so f b a cc l 伽e6 0 8w e r ec s 协l m dw i mb i i l a r yv e c t o r s p c a m b i a l 3 0 0 拍d p y l 胜c 7 4 7 ht e 辨6 v e l y t h e l i b m r i e s w i 也p c a m 认柚d p y l 融c w 啪c s i 咖do f 3 9 6a 埘2 c l 佃e s t e s p e c t i v e l y 锄dm ei l l s e f ts i 髓删 g e da t6 1 2 k b 锄d1 0 2 5 k b m s p e c t i v e 耻 7 g e n e d 妇i o no fb a c6 0 8w 站碑晌加e dw 怂r j c e g 从ss y s t e m s e q u 哪c e 锄a l y s i so ft l l i s i i 托g i o n 删c a l e d 也a to r f 4 5 6 7a n d8c o u l d b e 血ec 姐d i d 咖so f 劢 g e 1 1 1 ep c a 毋 险1 3 0 0 订a s f o r n l 撕o nc o n s 咖c t sr e s p e c 由e l yo o n 诅i n i n go r f 4 5 7 锄d8i n c l u d i n g5 p 瑚a o t 盯锄d3 u 1 r w c r es c 姗e do u t b u tn oc o n s 咖c t sw i 也c o 唧1 e t eo r f 6w a so b t a i l l e dd u et ot o ob i gs i z eo f o r f 6 衙 p c 舳i a l 3 0 0 1 1 8 0 仃孤s g e n i cp l a l l t sw e r eg e m t e db y 昭m 6 口c 据 埘l m e d i 砷丑仃孙s f 0 玎n a 6 衄 i t l l c o n 啦u c t sc o t a j d j g0 r f 4 5 7a l l d8r c s p e c n v e l y b u ta l ll h en 黜p l a n t ss h o w e ds l l s c 印曲l et or ep 6 o f 勋o 8 s r n a ic o n s 虮i c t so f o r f 4 5 6 7 锄d8 v 哪c 皿咖c t e dw i 也r n v e c t o rp c k 3 0 3a n d3o f t h er n a ic o n s t n l c t sw e r ef o ro r f 6 t h e s er n a ic 咄虮l c t sh a db e e nu s e dt o 甚n s f o r mc b b 2 3a n d z h o i i g y e l 9h a r 岫r i n g 肋刀g e i l e a n ds o m er e g e m t e dp l a n t sa r ep r 印a r e df o ri n o c u l a 虹o n 诵mm c ep 6 o f 放m k e y 啪r d s r i c e b a c t 嘶a l b g h t 皿2 3 m 0 1 e c u l a r m a r k e r s g c n o m e l i b r a m g c t l e h c 衄s f o r m 撕o n i i i 英文缩写 r f l p b l a s t s n p s s r p a g e p c r n i l n b s l r r e b d d h o r p m b p k b m b a m p k a n r i f i p t g x g a l 2 4 d i a a n a a 6 b a k t c a r b c e f o r f h y g a s 英文缩略词表 英文全称 r e 嘣c t i f r a 鲫 tl g l l ip o l y l n o 咄i s m b 船i cl 0 c a la 地皿m e n ts e a r c h1 l o o l s i n g l en u c e o d ep 0 1 y m o r p h i s m s i m p l es e q u c e 黜伊a t p 0 l y a a l 蛳i d eg e le l e m o p h o 瑚i s p o l y m e r a c h a i nr e a c 廿o n n e i s o g i cl 证e m l c l e o t i d cb i n d i n gs 沁 k 札c i n e r i c hr 印e a t e t h i d i u mb 咖i d e d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r r e v o l u t i 佃sp e rm 协l i t e b a s ep a i r k i l o b 啦e m i l l i o n b 嬲e a m p i c i l l i n k y c i l l r i f h m p i c j l l i s 0 1 r o p y l p d 抽i o g a l t 0 一p y m n o s i d e 5 一卧o m o 4 c h l o r o 3 l n d o y l b d 七a l a c t 0 懈瑚o s i d c 2 4 d i c l d o r p h c i l o x y i n d o l e 一3 一 e t i ca c i d n 印h 曲c 甜ca c i d 6 b e n 巧l m i n op u 血e 6 f u 咖r y l 锄i n op l l r i n e c a r b e n i c i l i i n c e f a i o t i i ls o d i u m o p e i lr d i n gf t a m e h y g r o m y c i l lb a c e t o s y 血g o n e v i i 中文名称 限制性片段长度多态性 局部基本序列搜索工具 单核苷酸多态性 简单序列重复 聚丙烯酰氨电泳 聚合酶链式反应 近等基因系 核苷酸结合位点 亮氨酸重复 溴化乙锭 双燕无菌水 每分种转速 碱基对 千碱基对 兆碱基对 氨苄霉素 卡那霉素 利福平 异丙基一b 蜥代半乳糖苷 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚一d 半乳糖苷 2 4 二氯苯氧乙酸 吲哚乙酸 萘乙酸 6 一苄氨基腺嘌呤 6 一糠基氨基嘌呤 羧苄青霉素 头孢噻吩钠 开放阅读框 潮霉素 乙酰丁香酮 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意 研究生签名 旋 时间 2 6 年6 月1 6 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留 使用学位论文的规定 即 中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩 印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 论文储躲凝彩 帆 赢年6 肌日 轹桫彳帆2 0 0 6 1 6 日 第一章文献综述 1 1 植物抗病基因研究进展 植物病害是农业生产中的主要限制因子之一 实践证明克服植物病害经济有效途径是 利用抗性资源培育抗病品种 但由于人们对植物抗病性的复杂性和对植物与病原物互作机制 的匮乏 抗病育种一直是农业科研中的热点 随着分子生物学的发展 多个植物抗病基因以 及病原菌无毒基因被克隆分离出来 使得对寄主与病原菌的相互作用机理有了初步的认识 为抗病基因在生产上的应用进行了有益的探索并展示了诱人的前景 1 1 1 植物抗病反应与基因对基因学说 几乎所有的高等植物 生长自然界中就会受到其它生物 病原菌以及其所处生态环境的 威胁 植物在长期的进化和自然选择中获得了一系列复杂的防御机制来保护自己从而得以生 存和繁衍 这种机制既有专一性的抗性 也有非专一性的抗性 其抗性的表达有的是组成型 的 有的为诱导型的 寄主植物可采用多种方式或途径来抵御病原的侵染 一方面如植物自 身的组织 器官等结构障碍和所含有的化学物质或小分子物质可以阻止病原菌的侵染和生长 另一方面植物在受到病原菌侵染后表现出抗病性反应 前者主要是指过敏性反应 h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n h r 即当植物受非亲和性病原菌感染后 侵染部位细胞迅速死 亡 使病原菌不易获取养分 同时又诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质 从而限制了 病原菌的增殖 在该过程中的细胞死亡称为细胞程序化死亡 p r o g r a m m e dc e d e a t h d 8 n g l e ta l 1 9 9 6 而后者是建立在前者基础之上的 又称系统获得抗性 s y s t e a c q u i r e d r e s i s t a n c e s a r d u r r a n ta i l dd o n g 2 0 0 4 它是指植物受病原菌侵染后会产生 类信号 分子 这种信号分子能诱发整个植株防卫基因的表达 从而使植物对病原菌产生抵抗作用 在植物界中还存在着这样一种抗病反应 即一种病原可侵染某种植物 但却不能侵染其它植 物 这种现象称为非寄主抗性 n o n h o s tr e s i s t c e 陈功友等 2 0 0 2 m y s o r ea n dr y u 2 0 0 4 由于这种抗性在多数情况下没有小种专一性 且抗性持久 所以在生产上有更大的应 用价值 它将会是未来植物抗病性研究的重要发展方向之一 从本世纪初人们已经认识到抗性也同其它性状一样符合孟德尔遗传规律 育种家们开始 用寄主抗性来保护作物 从而也促进了植物病理学研究的发展 f 1 0 r 在他的研究中证实亚麻 对真菌m e l a p s e r al i n i 的抗性是一对分别来自宿主和病原菌的相关基因相互作用的结果 在 此基础上提出了基因对基因学说 g e n e f o r g e n eh y p o t h e s i s f l o r 1 9 7 1 这个模型简 单明了地描述了植物与病原苗相互作用的情形 通过对植物与病原物的相互作用研究发现 在许多情况下 植物抗病反应受到两个明显的基因位点控制 即病原物的无毒基因 a v i r u l e n c eg e n e a v r 和植物对应的抗病基因 r e s i s t a n c eg e n e r 基因 所控制 缺乏其 中任一基因位点 寄主植物都将表现感病反应 这种遗传互作被称为基因对基因理论 g e n e f o r g e n et h e o r y 它构成了克隆病原菌无毒基因和植物抗病基因的理论基础 1 1 2 植物抗病基因的克隆策略 抗病基因是植物一病原菌相互作用中的一个关键因子 是研究植物抗病机制的基础 抗 病基因的克隆将有助于更快地揭示寄主与病原茵相互作用的分子机理 推动植物分子病理学 的发展 同时抗病基因的克隆也推动了转基因抗性农作物的种植和生产 增加了农作物抵御 病虫害的能力 提高了农作物的产量和品质 因此 对抗病基因的分离成为各国科学家研究 的热门课题 并己取得显著进展 j o h na i l dw o f f e n d e n 2 0 0 3 据不完全统计 人们己利 用不同的方法从各种粮食 经济作物和其他植物中克隆出5 0 多个抗病基因 表1 从表l 可 以看出 不同的植物克隆到的r 基因的数量是不一样的 这是由于各种植物基因组研究的基 础不同 如遗传图谱 物理图谱的紧密度 转座子研究的情况以及转化方法的难易 使从不 同植物中克隆r 基因的难度不同 基因组小的分子生物学研究基础较好的模式植物如拟南芥 番茄 水稻比较容易克隆到r 基因 而基因组大的 分子生物学研究还不够深入的植物则克 隆r 基因相对困难 从表中可以看出 植物r 基因结构与抗何种病原茵并无直接联系 大部 分r 基因具有共同的特征保守结构域如n b s l r r 但是有些r 基因并没有这些保守结构域 这 说明了r 基因具有丰富的多样性 也暗示r 基因可能通过多条代谢途径启动抗病反应 克隆基因的途径通常分为正向遗传学和反向遗传学 前者是依据目标基因所表现的功能 为基础 通过鉴定其产物或表型突变而进行 反向遗传学则着眼于基因本身 根据基因在基 因组中的位置进行 然而 由于人们对r 基因产物 特性知之甚少 加之突变体难以确定或 创造等原因 目前用正向遗传学来克隆抗病基因较少 在植物抗病基因的分离克隆中 图位 克隆 p o s i t i o n a lc l o n i n go rm a pb a s e dc l o n i n g 又称定位克隆 和转座子标签技术 t r a n s p o s o nt a g g i n g 这两种方法都得到了成功的应用 转座子标签法 是将转座子作为插入诱导剂 将转座子插入到欲分离基因的内部或附近 使目标基因突变 然后用插入d n a 为探针即可从被标识的突变体基因文库中克隆该基因 朱正 歌等 2 0 0 1 利用转座子标记克隆的抗病基因有玉米抗圆斑病基因 西 j o h a le ta l 1 9 9 2 番茄抗叶霉病基因倒 j o n e se ta l 1 9 9 4 凹 t h o m a se ta 1 1 9 9 7 烟草抗烟草花叶 病毒基因 w h i t h e ta l 1 9 9 4 亚麻抗叶锈基因 文 和刀 j e f fe ta 1 1 9 9 7 p e t e r e ta 1 2 0 0 1 图位克隆是基于基因遗传 物理图谱的克隆方法 其前提是有高密度的分子标记图谱 随着分子标记技术的发展 高密度遗传图谱和物理图谱的构建为人们克隆基因及分析提供了 十分有利的条件和丰富的信息 尤其是在基因组较小的一些模式植物如拟南芥 x 中国农业科学院博士学位论文第一章文献综述 l a c t u c as a t iv a肋 丹e 月f aj a c c ah b s l r r c a ps ic u ma n n u u m b 5 7妇n f 由d 皿o n a sc a 口芦e s j sn b s l r r j 墨 兰 兰生 二曼皇 2 皇 曼 生 1 1 1 3 植物抗病基因的结构 从1 9 9 2 年第一个植物r 基因胁 被克隆以来 已在多种植物中分离出4 0 个左右的r 基 因 虽然这些r 基因针对不同的细菌 真菌 病毒和线虫 但它们的产物大部分具有结构相 似性 根据已克隆的植物抗病基因编码蛋白的结构域特征 将植物抗病基因分为五类 图1 1 d a i l g la 1 1 dj 0 n e s t 2 0 0 1 m e y e r se ta 1 2 0 0 5 图11 檀物抗痔基因蛋白的5 个主要类型 引自d a n g ia n dj o n e s t 2 f i g 1 1r e p m n t 伽o f t h c l o c 砒i 佣孤d 曲 曲眦o f t l l c 6 v e m 面nc l a 端鹤o f p l a n i d i 辨越e 懈i s a n p r d c e j l l 嘶 d g l 舭dj 峨2 0 0 1 1 1 3 1n b s l r r k u c le o t i d eb in d in gs i t ep iu sl e u c in e r i c hr e p e a t 即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白 类 n b s l r r 类蛋白基因是植物抗病基因中数量最多的一类 这类抗病基因蛋白都包含一个核 苷酸结合位点 n b s 和亮氨酸的富集区 l r r 通过对这些抗病基因的n b s 区域结构分析发现 该区域包含一些非常保守的基序 根据n b s 前端 n 端 的不同结构 在植物中主要被分成两大 类 1 t i r n b s l r r 类型基因 这类抗病基因在n 一端包含 个与果蝇t o 儿蛋白及哺乳动物 白细胞介素一1 受体的胞外域相似的区域t i r t 0 1 la n di n t e r l e u k i n lr e c e p t o r 类似区域 t n l 类型基因主要被发现在双子叶植物中 拟南芥共有1 4 9 个n b s l r r 基因 其中9 4 个 占 6 3 1 为t i r n b s l r r 类型 m e y e r se ta l 1 9 9 9 2 0 0 3 而在水稻中仅发现极少的基因带 有t i r 结构 并且它们也不含l r r 结构域 因此 并不属n b s l r r 类型基因的范畴 b a ie ta 1 2 0 0 2 t i r n b s l r r 类型抗病基因包括肌 反敞邱口虽尬p 和励5 4 等 2 n o n t i r n b s l r r 类型基因 这类n b s l r r 基因n 一端不舍t i r 结构区域 它们又可以分为两类 一类在n 一端常 4 中国农业科学院博士学位论文第一章文献综述 带有一个螺旋卷曲 c o i l e d c o i l c c 结构区域 这类基因被称为c c n b s l r r 类型基因 这类 拣赢基阻包括r p m i r p s 5 置p p 8 x a l p j 9 p r f m 融l r x 2 勋p 1 3 m a i m l a 6 p i b 丹招和 口等 其中厅9 的n o n t i r 基序 m o t i f 与丹6 和丹f a 的n o n t i r 基序同源性分 别为5 7 和6 1 q ue ta l 2 0 0 6 户f f a 编码的蛋白又与n b s 类的r 基因具有不同的特点 其蛋白n 一端缺少l r r 基序和t i r 结构 而是亮氨酸重复结构域 l r d b r y a i le ta l 2 0 0 3 拟南芥的1 4 9 个n b s l r r 类型基因中有5 5 个 占3 6 9 是n o n t n l 类型基因 其中5 l 条 占 3 4 2 是c c n b s l r r 类型基因0 l e y e r se ta l 2 0 0 3 另一类为在n 一端带有未知结构的抗 病基因 因此被称为x n b s l r r 类型基因 包括 助卜执脚等 l r r 结构域参与蛋白一蛋白互作和与配体的结合 也可促进基因产物和参与防卫反应中信 号传导的其它蛋白质的作用 n i x o ne ta l 1 9 9 6 却妇 皿 和 基因l r r 结构域中单个 氨基酸的改变就导致过敏反应的能力的丧失 b e n te ta l 1 9 9 4 g r a n te ta 1 1 9 9 5 这表明 l r r 结构域中微小的修饰就能容易地破坏l r r 的功能 n b s 具有a t p 或g t p 结合活性 r 基因 中n b s 结构域的高度保守性说明核苷酸结合对r 基因发挥功能是必不可少的 有趣的是船j 基因与以前研究的其它抗性基因不同 屁j 基因的表达可以被病原菌侵染和创伤诱导 1 1 3 2 胞外l r r 蛋白类 番茄纾一 4 虽9 等抗病基因编码的蛋白产物是锚定在细胞膜上的细胞外糖蛋白 它 的胞外结构域是由l r r 构成 而没有n b s 位点 t 等抗病基因编码的蛋白产物具n 端信号肽 进一步分析表明这几个基因的l r r 结构域比n b s l r r 类蛋白的l r r 结构域更均匀一致 且 其l r r 中有一保守的甘氨酸残基 它们之间高度同源 尤其是后面9 个l r r 几乎相同 清楚 地表明了它们之间的相关性 这和它们所抵抗的是共同的病原物c 血 r 的特异小种也是吻 合的 拥有l r r 结构的蛋白不仅可以接受来自病原菌配体 有可能就是 基因编码的肽 信 号 而且还可与其它结构的蛋白结合起作用 删蛋白拥有多个l r r 结构域 这样它可以与 a v r 9 编码蛋白结合外仍可与其它的蛋白相互作用 共同参与植物防卫反应中的信号传递 j o n e se ta 1 1 9 9 4 1 1 3 3 受体激酶蛋白类 激酶作为生物信号传导途径中的重要组分 一直倍受重视 来自番茄的尸如基因 编码 丝 苏氨酸激酶 对携有无毒基因8 m p 幻的咫p 如 a s 盯一聊ep v 细生理小种表现 抗性 研究表明无毒基因蛋白a v r p t o 和p t o 蛋白直接相互作用激发了尸幻的功能 t a n ge t a l 1 9 9 6 同时p t o 也参与信号传导级联反应的其它蛋白相互作用 但是p t o 蛋白抗性功能 的实现还需要n b l r r 蛋白p r f s a l m e r o ne ta 1 1 9 9 6 1 1 3 4l r r t m p k 跨膜受体激酶 蛋白类 中国农业科学院博上学位论文第一章文献综述 水稻抗白叶枯病基因脚j 是目前这类基因中最早克隆的一个r 基因 它编码l r r t m p k 类蛋白 其n 一端是个疏水的信号肽 其后有2 3 个不完备的以2 4 个氨基酸为单位的胞外l r r 结 构 以及一个疏水的跨膜螺旋结构和胞内的蛋白激酶 丝 苏氨酸 结构域 s o n ge ta l 1 9 9 5 从整体上看肠引产物是一个具有激酶活性的跨膜受体 从结构上看它的功能似乎是完备的 其胞外受体结构 l r r 可与来自病原物的a 基因产物 配体 结合 感知病原侵染的信号 通 过信号传导来活化细胞内丝一苏氨酸蛋白激酶的表达 从而激活细胞内一系列的反应 最终 介导h r 反应的表现 由于它是第一个包含两个结构域的抗性基因 因此属于新的一类抗性基 因 它的结构对于研究植物抗性基因的作用机制具有重要意义 屁筋是个组成性表达的基因 其编码产物与妇删相似 包含一个n 端3 0 个氨基酸的信 号肤 胞外l r r 是由2 6 个不完全的富含亮氨酸重复区组成 有跨膜区和胞内丝氨酸 苏氨酸 激酶区 s t k s u ne ta 1 2 0 0 4 1 1 3 5c c t c o ie d c o lp iu st r a n s m e m b r a n er o c e p t o r 即卷曲螺旋结 构的跨膜受体 类 胛糌是拟南芥抗白粉病基因 编码蛋白为一个小的跨膜结构域和卷曲螺旋结构域 即卷 曲螺旋的跨膜受体 目前与已经克隆的基因没有同源性 x i a oe ta l 2 0 0 l 2 0 0 5 1 1 3 6 其它类型抗病基因 玉米砌 编码一个依赖于n a d p h 的h c 一毒素还原酶 t o x i n r e d u c t a s e h c 一毒素是真菌 c o c h l i o b o l u sc a r b o n u mr a c e l 产生的致病因子 它使病原菌能够侵染某些基因型的玉米 它 是第一个被克隆到的植物抗病基因 但由于不能产生毒素的病原并不能侵染无h m l 基因的玉 米品种 所以它的抗病机制不符合基因对基因假说 j o h a la i l db r i g g s 1 9 9 2 大麦抗白粉病基因卅口是一个非小种专化性抗性基因 它对已知的自然界大麦自粉病菌 株均表现为抗病 不符合基因对基因模式的抗病基因 该基因编码的蛋白中含有至少6 个跨 膜蛋白螺旋 m e m b r a n es p a i l n i n gh e l i c e s 但没有其它r 基因的类似结构 b u s c h g e se ta l 1 9 9 7 水稻抗白叶枯病 占基因是一个隐性基因 其编码的产物为转录因子i i a 的y 亚基 t h e g 绷m as u b u n i to ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r a t f i i a y 其抗病基因船5 和感病基因胎5 产物只有一个氨基酸的差异 l y e r dm c c o u c h 2 0 0 4 j i a n ge ta l 2 0 0 6 水稻抗白叶桔病m 口 基因及感病等位基因z 以7 编码的蛋白没有任何差异 均编码含有2 个h 结构域的蛋白 其抗 感间的差异是在基因的调控区 胎 7 基因是典型的符合基因对基 因学说模式的抗病基因 无毒基因a v r x a 2 7 与抗病基因肠2 相互作用时诱导抗性的产生 研 究表明胎 基因的表达受病原菌 型激发子的诱导 抗病品种只有在接种含有无毒基因 a h 妇 特异病原菌 z 脚ep v p x 0 9 9 后m 口 基因才表达 而接种其它的亲和 6 病原菌并不能诱导妇 基因的表达 g ue ta l 2 0 0 6 1 2 基因的图位克隆 图位克隆 m a p b a s e dc l o n i n g 又称定位克隆 p o s i t i o n a lc l o n i n g 用该方法分离 基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的 无须预先知道基因的d n a 序列 也无须预先 知道其表达产物的有关信息 但应有以下两方面的基本情况 一是有一个根据目的基因的有 无建立起来的遗传分离群体 二是开展以下几项工作 1 首先找到与目标基因紧密连锁的 分子标记 2 构建含有大插入片段的基因组文库 b a c y a c 或t a c 文库 3 以与目标基 因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库 4 用获得的阳性克隆构建目的基因的跨叠克隆 群 5 通过染色体步行 c h r o m o s ew a l k i n g 或染色体登陆 c h r o s ela 1 1 9 d i n g 获 得古有目的基因的大片段克隆 7 通过遗传转化和功能互补实验验证并最终确定目标基因 的碱基序列 目前图位克隆法是应用最为广泛的基因克隆方法 从植物中克隆出的许多抗病 基因都是利用图位克隆法获得的 王泽立等 2 0 0 0 图位克隆的关键步骤包括目的基因的精确定位 基因组大片段文库的构建和高效转化系 统的建立 目的基因的精确定位是通过已经构建的高密度分子遗传图谱来寻找物理距离上距 目的基因紧密连锁的分子标记 使得染色体步移的距离大大缩小或几乎不需要 这样染色体 步移就简化为染色体登陆 一旦找到共分离或紧密连锁的分子标记就可以用来筛选基因文库 从而分离出含有目的基因的克隆 1 2 1 分子标记技术研究进展 1 2 1 1r f l p 分子标记 r f l p 是检测d n a 在限制性内切酶酶切后形成的特定d n a 片段的大小 只要发生酶切位点变 异突变或d n a 片段重组 就会产生限制性片段长度多态性 最先是有b o s t e i n 等 1 9 8 0 提出 作为分子标记来构建图谱的 它是基于基因组d n a 分子杂交的方法 其基本步骤是 用识别位 点为4 8 个碱基的限制性内切酶酶切d n a 后 通过凝胶电泳分开d n a 片段 并转到尼龙膜上 用同位素 通常用 p 标记的d n a 片段作探针杂交 其特点是重复性好 实验结果稳定 但实验 周期长 信息量少 而且使用放射性同位素等 r f l p 广泛应用于各种作物的分子连锁作图和基因定位 并用于图位克隆和外源染色体检 测及物种起源与进化等方面的研究 目前已有2 0 多种植物建立了r f l p 连锁图 包括玉米 水 稻 番茄 小麦等 其中由h a r u s h i m a 等构建的水稻r f l p 图谱 经探针数量的不断增加 现在 已经有3 2 6 7 个r f l p 分子标记 h a r u s h i m ae ta l 1 9 9 8 h t t p r g p d n a a f f r c g o j p p u b l ic d a t a g e n e t i c m a p 2 0 0 0 i n d e x h t m l 这些r f l p 标记为水稻及其它禾本科作物的基因克 隆和分子标记辅助选择奠定丁基础 7 中国农业科学院博士学位论文第一章文献综述 1 2 1 2 简单序列重复长度多态性 s i m p i es e q u e n c er e p e a t s s r s s r 标记是以几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列 这种简单 序列的重复次数存在丰富的多态性 s s r 技术是利用微卫星重复序列两侧的保守序列设计引 物 扩增d n a 片段 从而检测出重复长度变化的多态性 由于s s r 多态性仅是由简单序列的 重复次数的差异引起的 通常表现为共显性 因此 其主要特点是共显性标记 重复性好 稳定性好 s s r 广泛分布于整个染色体组中 晟初被用于人类基因组研究 现在水稻 小麦 玉米 大豆等作物中也相继开展起来了 其中有m c c o u c h 等建立了水稻微卫星标记图谱上有 2 7 4 0 多个微卫星标记 使得基因定位更容易更快捷 m c c o u c he ta l 2 0 0 2 1 2 1 3 扩增片段长度多态性 m p i f i e df r a g m e n tl e n 譬t hp o iy m or p h is m f l p a f l p 是由r f l p 和p c r 技术结合而成 其基本原理是利用一个在基因组d n a 中酶切位点稀 少的内切酶 通常为六碱基内切酶 和一个酶切位点丰富的内切酶 一般为四碱基内切酶 的双酶组合 对基因组d n a 进行完全消化 消化后的d n a 片段进行选择性扩增 然后使用双 链人工接头 与基因组d n a 的酶切片段相连接作为扩增反应的模板 接头与接头片段相邻的 酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点 引物由三个部分组成 1 核心碱基序列 该序列与人工接头互补 2 限制性内切酶识别序列 3 引物3 端的选择碱基 选择碱基 延伸到酶切片段区 这样那些两端序列能与选择碱基配对的限制性片段被扩增 通过高分辨 率的测序胶上分开扩增产物 用放射性法 荧光法或银染法均可检测 典型的a f l p 分析每次 反应的产物经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测到的谱带数在5 0 1 0 0 条之间 多态性好的 酶切引物组合 一次可检测到2 0 个以上的多态性 所以它是一种非常有用的多态性检测的技 术 1 2 1 4 随机扩增多态性d n r a n d o m iy m p i i f i e dp o ly m ir p h i cd n r a p d r a p d 是用单个随机引物 8 1 0 个碱基 随机地扩增d n a 片段 然后用凝胶电泳分开扩增 片段