（食品科学专业论文）多功能植物小分子肽的研究.pdf

摘要 11liiii，il，lii。ll厂lll。lll3llll 摘要 本研究以植物蛋白( 大豆蛋白和花生蛋白) 为原料，采用微射流均质技术 结合复合酶酶解技术制备功能性小分子肽，研究了微射流和复合蛋白酶酶解的 最佳工艺条件，并对小分子肽的结构和功能性质进行表征和分析，初探了多功 能性小分子肽的构效关系。 1 、在单因素实验的基础上，采用p l a c k e t t b u r m a n 设计，以酸溶蛋白肽的得 率为响应值，对影响植物蛋白水解的因子进行筛选。本实验选取了1 0 个相关因 子进行筛选，试验结果表明底物蛋白的浓度、第一次酶解时的p h 和温度这三个 为主要影响因子。 2 、在p l a c k e t t b u r m a n 设计的基础上，采用响应曲面法( r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ，r s m ) 分析，以酸溶蛋白肽的得率为响应值，对底物蛋白的浓度、 第一次酶解时的p h 和温度3 个关键因素的最佳水平进行了优化。经求解二次多 项回归方程得知，底物蛋白的浓度为8 9 0 、第一次酶解时溶液的p h 为8 0 4 、 温度为5 7 8 0 时，其酸溶蛋白肽的得率最高为8 8 1 1 ，相关系数为0 9 5 1 6 ，所 建模型极其显著( p f 小于0 0 5 ) 。模型失拟项( l a c ko f f i t ) 表示模型预测值与实际值不拟合的概率。表5 中模型失拟项p r o b f 为 3 7 第2 章复合酶酶解工艺优化 0 0 5 3 6 0 0 5 。因此，模型失拟项不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项， 模型选择合适。同时，模型的相关系数r 2 为0 9 5 1 6 0 9 ，模型拟合程度很好。 变异系数( c v ) 反映模型的置信度，c v 值越低模型的置信度越高，本试验的c v 值为1 1 5 ，说明模型方程能够很好的反映真实的试验值。所以，可以用该模型 来分析响应值的变化。还可以看出对响应值的贡献是：第一次酶解时溶液的温 度( c ) 第一次酶解时溶液的p h ( b ) 第一次酶解时底物蛋白的浓度( a ) 。 通过d e s i g n e x p e r t 软件绘制响应面曲线的直观分析图，见图2 9 。 2 铂 e 一 舞鳝篓霪囊 ：，是i 。席囊够参豪笋霉镑 图2 9 响应面曲线图 f i g 2 9r e s p o n s es u r f a c ec u r v e 对响应面结果利用软件进行最优化分析，在底物蛋白通过微射流的压力为 8 0 m p a 、第一次酶解的酶用量为3 、第一次酶解所用的时间为3 h 、第二次酶解 时溶液的p h 为8 0 、第二次酶解的酶用量为3 、第二次酶解时溶液的温度为 第2 章复合酶酶解工艺优化 5 0 。c 、第二次酶解的时间为3 h 的条件时，以酸溶蛋白肽的百分含量为评价指标， 确定其酶解的最优条件为底物浓度为8 9 0 ，酶解的p h 为8 0 4 ，温度为5 7 8 0 。c ， 最后的水解液中酸溶蛋白肽的百分含量为8 8 1 1 。 2 4 本章小结 1 、在单因素的基础上，再通过p l a c k e t t b u r m a n 实验设计，对水解植物蛋白 条件的诸多相关因子进行了评价，成功地筛选出对酸溶蛋白肽的得率具有显著影 响的因子为：底物浓度、第一酶解的p h 、第一酶解时的温度，其中进一步说明 了第一次酶解是酸溶蛋白肽得率的主要影响反应过程。 2 、为了获得最佳的试验结果，在p l a c k e t t b u r m a n 实验的基础上，以底物浓 度、第一酶解的p h 、第一酶解时的温度为因子，以酸溶蛋白肽得率为响应值， 设计三因素三水平的二次回归方程来拟合因素和指标( 响应值) 之间的函数关系， 采用b o x b e h n k e n 响应面分析法来寻求酶解最优工艺参数，对酸溶蛋白肽得率 的作用由大n 4 , 依次为：第一次酶解时溶液的温度 第一次酶解时溶液的p h 第一次酶解时底物蛋白的浓度。 3 、最佳工艺参数是：底物蛋白通过微射流的压力为8 0 m p a 、第一次酶解时 溶液的p h 为8 0 4 、底物蛋白的浓度为8 9 0 、第一次酶解的酶用量为3 、第 一次酶解时溶液的温度为5 7 8 0 、第一次酶解所用的时间为3 h 、第二次酶解时 溶液的p h 为5 5 、第二次酶解的酶用量为3 、第二次酶解时溶液的温度为5 0 、 第二次酶解的时间为3 h 。响应值酸溶蛋白肽的得率为8 8 1 1 。 3 9 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 3 1 引言 第3 章小分子肽的纯化及其活性研究 氨基酸通过肽键相互键连而成的化合物称为肽，由1 0 个以上氨基酸组成的 肽称多肽。少于1 0 个氨基酸肽称寡肽又称小分子肽。由3 个氨基酸组成的肽称 三肽，由2 个氨基酸组成的肽称二肽。 凝胶分离法是一种有效而又简便的生物化学分离方法。凝胶层析又称凝胶 过滤或分子排阻层析【7 1 1 ，是通过被分离物质的分子量的差异为基础的一种层析 分离技术，该技术为纯化蛋白质、多糖、淀粉、生物碱等生物大分子提供了一 种非常温和的分离条件。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是： 具有各种孔径范围的琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 和葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3 氯l ，2 环氧丙烷交联而成的 具有多孔网状结构的高分子聚合物。凝胶颗粒中网孑l 的大小可通过调节葡聚糖 及交联剂的比例来控制交联度的大小。交联度越小，网孔结构就越疏松；交联 度越大，网孔结构越紧密，分子量大于允许进入凝胶网孔范围的分子完全被凝 胶排阻，阻滞作用小，跟随溶剂在凝胶颗粒外部流动，因此流程较短，而先流 出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程 较长，因此最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进 入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离。 质谱主要用于鉴定蛋白质亚基和测定不同来源的肽和蛋白质的分子质量。 该方法灵敏度很高，可被检测的蛋白质的分子质量的精密度小于0 0 1 【7 2 】，如此 高的精密度主要归功于一些软电离技术的应用，如电喷雾( e s i ) 并i 基体辅助激光 解吸电离( m a l d i ) 。生物大分子多为极性、难挥发化合物、不易气化，用传统质 谱无法测定。但随着新的离子化技术的广泛应用，现已能高效地电离一些完整 或片断的大分子生物聚合物，从而进行质谱测划7 3 】。 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 3 2 材料与方法 3 2 1 实验材料 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 2 5 ( p h a r m a c i a ) 、注射器( 江西三鑫医疗器械有 限公司) 、o 2 2u m 微滤膜 3 2 2 试剂 表3 1 实验试剂 t a b l e3 1e x p e r i m e n ta g e n t s 3 2 3 主要仪器与设备 4 1 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 表3 2 实验仪器与设备 t a b l e3 2e x p e r i m e n ti n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 仪器设备名称 产地和产家 数控记滴自动部分收集器b s 1 0 0 a l c d 恒流泵b t l 2 0 0 玻璃层析柱1 6 6 0 紫外检测器h d 2 1 8 8 色谱数据j 二作站n 2 0 0 0 u l t r a h y d r o g e l t m5 0 0c o l u m n ( 7 8 x 3 0 0 m m ) s m a r t l i n e 示差折光检测器2 3 0 0 高效液相色谱 恒温恒湿培养箱p y x 15 0 h b t 6 新世纪紫外分光光度计 高速离心机 数显恒温水浴锅h h 4 j j 1 精密定时电动搅拌器 k q 10 0 d e 型超声波清洗器 y d 6 0 0 n 电子大平 j d 2 0 0 3 b 电子天平 实验室p h 计f e 2 0 w h 8 6 6 旋涡混合器 h p l c 2 6 9 5 一m s z q4 0 0 0 上海琪特分析仪器有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 上海琪特分析仪器有限公司 浙江大学智达信息上程有限公司 w a t e r s 公司 德国诺尔 大连依利特分析仪器有限公司 广东韶关科力实验仪器有限公司 北京普析通h j 仪器有限责任公司 t h e r m o 国华电器有限公司 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 昆山市超声仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 沈阳龙腾电子有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 太仓市科教器材厂 w a t e r s 3 2 4 实验方法 3 241 葡聚糖凝胶纯化 ( 1 ) 选用葡聚糖凝胶g 2 5 ，经蒸馏水浸泡，再在沸水中溶胀活化3 0 r a i n ，倾 去悬浮的小颗粒，然后冷却装柱。 ( 2 ) 先封闭层析柱出水口，向柱内加入l 3 柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的 凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。待凝胶沉降约3 - 5 c m 高后， 打开柱出水口，调节流速为l m l m i n ，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到距 离柱的顶端约1 0 c m 处停止装柱，用蒸馏水平衡2 3 h 即可加样品分离。 ( 3 ) 先将样品过0 2 2 9 m 的微滤膜后备用，关闭层析柱出水口的夹子，吸出 层析柱上层的蒸馏水直至与胶面相切，沿器壁将样品溶液小心的加到层析柱内， 打开下口夹子使样品溶液流入柱内，当样品溶液流至与胶面相切时关闭出水口 4 2 色谱柱：u l t r a h y d r o g e lt m5 0 0 色谱柱( 7 8 3 0 0 m m ) 检测器：示差检测器 流动相：超纯水 流速：0 6 m l m i n 进样量：2 0 i - t l 柱温：3 5 ( 3 ) 标准曲线的绘制 拟合曲线的定标方程：y = a + b x 式中a ，b 为常数 y ：l o g m x ：保留时间t 保留时间、分子量、柱的结构、尺寸凝胶粒度、孔径、孔容及色谱条件诸 因素有关，是凝胶色谱柱的重要参数，在柱的结构、尺寸凝胶粒度、孔径、孔 容及色谱条件恒定的情况下，保留时间t 与其分子量m 存在着对应的函数关系， 保留时间t 与其分子量m 的对数存在线性关系。 取一系列标准品，分别用流动相超纯水溶解，配制成0 5 的溶液( 用超声 波助溶) ；按( 1 ) 的色谱条件上机分析。标准品由小分子到大分子依次进样2 0 1 a l ， 记录色谱图得保留时间t ，应用软件绘制标准曲线，以标样在色谱柱上的保留时 间t 为横坐标，以标样分子量的常用对数为纵坐标进行线性回归计算。 将凝胶层析纯化后的小分子肽主峰溶液，按照( 1 ) 的色谱条件进样分析， 根据保留时间t 求得分子量。 4 3 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 3 2 4 3 小分子肽的活性测定 按照3 2 4 1 的方法纯化水解液，用自动收集器以五分钟一管的速度收集纯 化后的液体。 ( 1 ) 清除d p p h 自由基测定 7 4 1 取纯化后的小分子肽溶液2 0 m l ，加入0 0 0 4 d p p h 甲醇溶液2 0 m l ，经混 合后在室温下反应3 0 r a i n ，测定5 1 7 n m 处吸光度a i ； 测定d p p h 甲醇溶液2 0 m l + 乙醇2 0 m l 的吸光度； 水解液2 0 m l + 乙醇2 0 m l 的吸光度a i 。按下式计算d p p h 自由基清楚率。 d p p 日自由基清除率：1 1 - 兰；生1 1 0 0 4 式中：a o 对照组吸光度。 a i ：样品组吸光度； a i ：空白组吸光度。 ( 2 ) 胆固醇胶束溶解度抑制率的测定【7 5 】 1 2 5 m m o l 1 牛磺胆酸钠、1 6 5 m m o l 1n a c l 、6 3 m m o l 1 油酸、2 5 m m o l l 胆固 醇、1 9 m m o l 1p h 7 4 的磷酸钠缓冲溶液经过超声乳化混合，取混合液4 m l ，再加 入l m l 小分子肽。然后在3 7 c 培养2 4 h ，8 0 0 0 转分离心3 0 m i n ，取上清液测定 胆固醇含量。上清液中的胆固醇浓度即为胆固醇胶束溶解度m l ，以水溶液代替小 分子肽溶液为空白。按下式计算肽对胆固醇在模拟胆汁胶束溶液中的溶解度的 抑制率： 删率= 警1 0 。 其中：m l ：样品上层清液中胆固醇浓度； m o 空白溶液上清夜中胆固醇浓度。 胆固醇测定： 1 ) 试剂的配制 邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛5 0 r a g ，用无水乙醇定溶至5 0 m l 冷藏， 有效期为一个半月。 混合酸：冰乙酸l o o m l 与浓硫酸1 0 0 m l 混合。 2 ) 样品的测定 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 管号空白样品 样品(m1)0 o 4 0 邻苯二甲醛试剂( m 1 ) o 2 00 2 0 冰乙酸( m 1 ) 0 4 00 混合酸( m 1 ) 4 0 0 4 0 0 o d 值 加毕，温和混匀，2 0 - - 一3 7 。c 下静置1 0 分钟，与5 5 0 n m 下比色测定，测其 o d 值。 3 244 活性肽的结构初探 1 ) 按照3 2 4 1 的方法纯化水解液，用自动收集器以每分钟一管的速度收集 纯化后的液体。 2 ) h p l c m s 条件 质谱仪：w a t e r s2 6 9 5z q 4 0 0 0 离子方式：e s i + 毛细管电压：3 5 kv o l t s 锥孔电压：3 0v o l t s 离子源温度：1 1 0 。c 脱溶剂气温度：2 5 0 质量范围：5 0 5 0 0 r n z 光电倍增器电压：7 0 0v o l t s a n a l y s e rv a c u m m ：1 4 e - 5 m b a r g a sf l o w ：6 0 m l m i n 液相色谱：w a t e r s1 6 9 5 检测器：w a t e r s2 9 9 6 分析柱：d i k m ap l a t i s i lc 184 6 x 2 5 0 m m 流动相： 4 5 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 柱温：3 5 c 流速：0 6 m l m i n 进样量：1 0 “l 3 3 结果与讨论 3 3 1 葡聚糖凝胶柱纯化 凝胶过滤层析( g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ：也叫做分子排阻层析。一种 利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技 术。凝胶分离是利用被分离物质相对分子质量的不同，通过具有分子筛作用的 凝胶( 固定相) 的移动速度不同，从而使物质分离。交联葡聚糖( s e p h a d e x ) 是 柱 主 有 7 8 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 图3 2 蛋白水解液的凝胶色谱图 f i g 3 2g e lc h r o m a t o g r a m so fh y d r o l y z a t e 从图3 1 可以得知，图3 2 峰m l 保留时间为3 3 m i n 为大分子物质，分子量 至少5 0 0 0 d ；峰m 3 保留时间为6 9 m i n ，在7 0 m i n 和5 2 m i n 之间即在分子量 3 0 7 d 6 1 3 d 之间；而峰m 4 保留时间为7 8 m i n 的小峰在7 0 m i n 之后即分子量小于 3 0 7 d ，很有可能是氨基酸。总体来说，植物蛋白水解后的产物m 3 分子量主要集 中在3 0 7 d 6 1 3 d 之间。 3 3 2 小分子肽分子量的测定 高效液相色谱( h i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh p l c ) 法按分离机制的 不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法( 正相与反相) 、离子交换色谱法、 离子对色谱法及分子排阻色谱法。排阻色谱法：固定相是有一定孔径的多孔性 填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留 时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛 对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化 合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 0481 2 1 62 0 052 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 051 01 52 051 01 5 2 0 a 为酪氨酸；b 为还原型谷胱甘肽；c 为氧化型谷胱甘肽；d 为杆菌肽 图3 3 四种标准品的色谱图 f i 9 3 3c h r o m a t o g r a mo ff o u r s t a n d a r ds u b s t r a t e 4 9 埔 墙 挖 9 6 3 旧8 6 4 2 0 8 6 4 2 2 l l l 1 1 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 表3 3 标准品的保留时间表 t a b l e 3 3s t a n d a r dr e t e n t i o nt i m et a b l e 标准物质分子量m i o g m 保留时间t 酪氨酸1 8 1 1 92 2 6 8 0 7 还原型谷胱甘肽3 0 7 3 32 4 9 7 5 7 氧化型谷胱甘肽6 1 2 6 32 7 9 7 1 3 杆菌肽 1 4 2 2 6 9 3 1 56 3 3 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 3 2 5 2 1 - 5 1 0 5 0 】0 】族e 胶。垒 罂锄so t 由图3 5可知，峰m 3 的保留时 雩 为 7 y = - 0 5 2 3 3 x + 6 4 ：肽拘 3 3 3 清除d l p h 活性测定 0 5 0 4 5 一， o 4 秦 搦 兹 ：龙 国南 锡 j 镬 担婚 ! 爱 “：l - 薯r 口0 3 5 霾黝 4 皿 ：譬0 3 i - r - 0 2 5 1 - 害0 2 一函 函南陶 塾1 5 甜绀墓 0 1 0 0 5 4 04 55 05 56 06 57 07 58 08 5 9 0 时间m i n 图3 6 小分子肽清除d p p h 的能力 f i 9 3 6d p p hs c a v e n g i n ga b i l i t yo fp e p t i d e 5 1 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 从图3 6 可以看出，葡聚糖凝胶分离植物蛋白水解液，在6 5 7 0 m i n 分离出 来的溶液具有很强的清除d p p h 的活性，在6 5 m i n 之前，清除d p p h 的能力随 时间的增加而增大，也就是说清除d p p h 的能力随着肽的相对分子量的减小而 增大在7 0 m i n 之后，清除d p p h 的能力随时间的增加而急剧下降，即清除d p p h 的能力随肽的相对分子量的减小而增加。保留时间在6 5 7 0 m i n 的肽清除d p p h 的能力为4 4 7 8 。 谢正军【7 6 j 等人在研究苜蓿叶蛋白抗氧化肽水解用酶的筛选过程中表明酶 解物中相对分子质量小于1 0 0 0 d a 的组分所占比例最高，对d p p h 的清除率达到 6 7 8 6 。程云辉1 77 j 等人在研究酶解麦胚蛋白制备抗氧化肽时，研究表明最佳条 件下制备麦胚抗氧化肽的对d p p h 的清除率为5 9 5 5 。 3 3 4 抑制胆固醇胶束溶解性的测定 4 55 05 56 06 57 07 58 08 5 9 0 时间( r a i n ) 图3 7 抑制胆崮醇胶柬溶解性图 f i g3 7i n h i b i t i o no f c h o l e s t e r o lm i c e l l a rs o l u b i l i t yd i a g r a m 从图3 9 可以看出，总体趋势是在6 0 m i n 之前随时间的增加抑制率呈有上升 趋势，7 0 m i n 之后随时间的增加抑制率呈有上升趋势。在6 0 7 0 m i n 之间较好的 抑制胆固醇胶束的溶解，抑制率可达到7 3 2 。 张晓梅在降血压和降胆固醇大豆肽的分离纯化中，得到大豆肽对胆固醇胶 束的溶解度的抑制率高达9 0 3 4 。该肽的相对分子质量为7 7 2 4 d a 。本试验得 5 2 加的们加0 一葶一静器晕越琏矮长垡链匿罨 2 田锄7 5 0彻1 2 蜘伽佃姗2 2 5 02 锄丑卯跏础姗 图3 8 峰m 3 的色谱图 f i 9 3 8c h r o m a t o g r a m so fp e a km 3 从图3 8 可以得知，峰m 3 的小分子肽在2 2 0 n m 波长下的液相色谱图。在 5 4 m i n 、1 6 2 5 m i n 、2 9 5 m i n 和3 4 7 3 m i n 有显著峰，将四个显著峰分别记做p p 1 、 p p 一2 、p p 3 、p p - 4 ，对这4 个峰进行质谱分析，其质谱图分别见图3 9 、图3 1 0 、 图3 1 1 、图3 1 2 。 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 8 01 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 02 0 02 2 0 2 4 02 6 02 8 03 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 图3 9 p p - 1 的质谱图 f i 9 3 9p p - 1m a s ss e p e c t r o g r a m 从图3 9 可看到，碎片离子峰在3 8 9 5 3 有响应该峰可能是分子离子峰( m + l 峰) ，3 4 4 1 6 处的碎片离子峰可能是分子离子峰3 8 9 5 3 脱 h c o o h 得到，且3 4 4 1 6 处的峰比3 8 9 5 3 处的峰高的多，说明该肽易脱羧；丝氨酸的相对分子量为 1 0 5 0 6 d a ，脱去一个 c o o 得到7 2 的碎片离子峰，一般n 末端的易脱羧，丝氨 酸可能在n 末端；赖氨酸或谷氨酰胺的相对分子量为1 4 6 1 3 d a 、1 4 6 0 8 d a 脱 n h 3 1 得到1 2 9 8 3 的碎片离子峰，在此基础上脱去一个 c o o 得到8 5 7 3 的碎片离子峰； 精氨酸的相对分子量为1 7 4 4 d a ，脱去一个【n h 3 得到1 5 8 1 0 的碎片离子峰，该 氨基酸只脱去 n h 3 】。且丝氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺、精氨酸组成的肽的相对分 子量为3 8 9 d a 与3 8 9 5 3 d a 接近。在该处得到的小分子肽的可能结构为s r q 或 s r k ，其结构如图3 1 0 。同时，也可以看出小分子肽的分子量为3 8 9 d a 。 第3 章 0t t0 jj h ，n 一( _ c n h c c 一 il 严严 0 1 ：rc 岛 。 c 岛 i n h i c = 0 n m 图3 1 1p p - 2 的质谱图 f i 9 3 11p p - 2m a s ss e p e c t r o g r a m 图3 1 1 ，图谱的峰太乱，没有很明显的峰，很难推测其含有的小分子肽的结 构，但可以看出该部分可能含有的氨基酸，t h r 苏氨酸( m = 1 1 9 1 8 d a ) 脱羧得 到7 4 8 4 的碎片离子峰；g l u 谷氨酰胺( m = 1 3 3 6 ) 、a r g 精氨酸( m = 1 7 4 4 ) 通 过脱氨分别得到1 2 8 6 3 和1 5 6 8 5 的碎片离子峰；a s p 天冬酰胺( m = 1 3 3 6 ) 获 得一氢正离子得到1 3 4 6 4 的分子离子峰。该部分可能含有苏氨酸、谷氨酰胺、 5 5 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 精氨酸、天冬酰胺等氨基酸。 s c a ne s + 1 0 5 1 毋t 3 吊3 0 6 2 01 0i 尹礓9 5 2 3 7 1 7 0 4 4 1 8 8 6 jj 。6 一i l l 【f 1 1 i j ；i l i l “l l j j | i “l 一i l 一i l j i i l i q l 8 01 0 0 t 2 01 4 01 6 01 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 图3 1 2 p p - 3 的质谱图 f i 驴12p p - 3m a s ss e p e c t r o g r a m 2 6 e 5 7 9 m l z 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 从图3 1 3 可知，1 1 0 3 、1 3 8 4 4 和1 5 5 9 6 可能是组氨酸的碎片离子峰，6 9 0 2 可能是异亮氨酸或亮氨酸的碎片离子峰，图中3 8 4 0 1 可能是分子离子峰，这个 小分子肽可能是由异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成，其可能结构为 d h i 或d h l ，其结构如图3 1 4 。同时，也可以看出小分子肽的分子量为3 8 3 d a 。 h o 丑o h 0 i i i f li h 2 n f _ c - l 耻r c - n h r c - 。h 嘞锄嘞 0 = c i h n c 奄c h c i t - c a 3 o ih、 c l a 3 h c ：b l ohoh0 i i i i i i i h 讲一p c n h e c n h e c - 一o h i i 嘞锄c h c a 3 i i 。善h k n 、尽，c h 严c h 3 i - i c ：n 图3 1 4d h i 和d h l 的结构图 f i 够1 4s t r u c t u r eo f d h l o rd h l d a e y o u n g k 、o n f 7 8 1 等从大豆蛋白水解液中分离纯化得到一种降胆固醇活性 肽l p y p ，并证明n 末端的亮氨酸残基对降胆固醇活性起决定性作用。张晓梅例 等人在降血压和降胆固醇大豆肽的分离纯化研究中，研究表明降胆固醇大豆肽 中c 末端含有异亮氨酸和亮氨酸残基。本研究所得的小分子肽为d h i 或d h l ， 结果中也是c 末端含有异亮氨酸和亮氨酸残基，与张晓梅研究的肽在这点上相 同，肽的降胆固醇性质与c 末端含有异亮氨酸和亮氨酸残基有着非常密切的关 系。 h u a - m i n gc h e n 8 0 】等人利用大豆蛋白水解获得抗氧化肽 l e u l e u p r o h i s h i s ，其研究表明当去掉n 末端l e u 亮氨酸，对抗氧化活性几乎 没有影响；而当去掉c 末端h i s 组氨酸，抗氧化活性下降。说明c 末端h i s 组 氨酸对小分子肽的抗氧化活性起到决定性的作用。本试验中的小分子肽d h i 或 d h l 其中肽的中间位置含有h i s 组氨酸，同时也具有抗氧化性，说明h i s 组氨 酸可能对抗氧化性起着一定的作用。 3 3 5 2 峰m 4 ( 保留时间为7 8 r a i n ) 的结构 按照3 2 4 1 的方法纯化出来的小分子肽进行h p l c m s 对其结构进行初步 的测定。如图3 1 5 是在7 8 m i n 纯化出来的小分子肽在2 2 0 n m 的波长下检测。 5 7 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 锄伽僦砌 础姗姗舢彻 图3 1 5 峰m 。的色谱图 f i 9 3 15s p e c t r o mo f p e a km 4 从图3 1 5 可以得知，在4 6 5 m i n 和5 2 0 m i n 有显著峰，将这两个峰分别记做 a - 1 、a - 2 ，对这2 个峰进行质谱分析，其质谱图分别见图3 1 4 和图3 1 5 。 7 9 32 图3 1 6a - 1 的质谱图 f i 够1 6a - im a s ss e p e c t r o g r a m 从图3 1 6 可知，a 1 的质谱图中只有一个峰，其很有可能是一个氨基酸的碎 片离子峰，丙氨酸的分子量为8 9 0 6 ，脱去一个n h 3 ，得到7 2 0 6 的碎片峰，与 7 1 9 3 相差0 1 3 ，舢1 出来的物质很有可能是丙氨酸。 5 8 第3 章小分子肽的纯化及其性质的测定 1 3 1 7 3 1 8 01 0 01 2 01 1 01 6 01 8 02 0 0 2 2 02 4 02 6 02 8 0 3 0 03 2 0 3 4 0 3 6 03 8 0 4 0 04 2 04 4 0 图3 1 7 a - 2 的质谱图 f i 9 3 17a - 2m a s ss e p e c t r o g r a m 从图3 1 7 可知，a - 2 的质谱图中有两个峰：8 6 0 4 和1 3 1 7 3 ，两个峰相差4 5 6 9 ， 相当于一个h c o o h ，也就是说从1 3 1 7 3 的碎片上脱去一个羧得到8 6 0 4 ，从而 说明1 3 1 7 3 很有可能是分子离子峰( m + h + ) ，即该物质的分子量为1 3 0 7 3 d a ， 而与1 3 0 7 3 相接近的氨基酸有异亮氨酸( m = 1 3 1 1 1 d a ) 和亮氨酸( m = 1 3 1 1 1 d a ) ， 综上说述，a - 2 的物质很可能是异亮氨酸或亮氨酸。 3 4 本章小结 ( 1 ) 本实验用s e p h a d e xg 2 5 很好的将小分子肽从植物蛋白水解液中分离 出来，且分离出来的小分子肽，都比较集中。 ( 2 ) 将s e p h a d e xg 2 5 分离出来的小分子肽用h p l c 法对其分子量进行测 定，本实验所得的肽主要都集中在分子量为4 0 0 d a 左右。 ( 3 ) 用h p l c m s 的方法对小分子肽的结构进行了初步研究，其中在用 s e p h a d e xg 2 5 分离中的峰m 3 的溶液中可能含有s r q 或s r k 、d h i 或d h l 等 小分子肽，从质谱图上进一步说明了，本试验水解所得的小分子肽的分子量为 4 0 0 d a 左右。而在用s e p h a d e xg 2 5 分离中保留时间为7 8 m i n 的溶液基本都是氨 基酸，从质谱图中找到了两种可能的氨基酸，它们是丙氨酸和异亮氨酸或亮氨 酸。 5 9 第4 章小分子肽的应用 4 1 引言 第4 章小分子肽的应用 肽是由氨基酸通过肽键连接而成的化合物，活性肽是介于氨基酸与蛋白质 之间的分子聚合物，它大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成，小至由两个氨 基酸组成，具有十分重要的生物和生理学意义，主要体现在其吸收机制优于氨 基酸以及具有氨基酸不可比拟的生理功能。而生物活性肽是指有特殊生理功能 的肽类。人类摄取蛋白经消化道的酶作用后，大多以小肽形式进行消化吸收， 很小以游离氨基酸形式进行消化吸收，进一步的研究又证明了小肽的吸收比游 离氨基酸的吸收更为迅速。对肽的营养作用的另一种新的认识是，蛋白在酶解 作用过程中可以产生一些具有特殊生理调节功能的生物活性肽。这些生物活性 肽本身以非活性状态存在于蛋白质的氨基酸序列中，当在胃肠道消化过程中， 或用适当的蛋白酶进行体外水解，以及食品加工过程中，它们就可能被释放出 来并发挥生理活性功能。 近三十年的研究表明，蛋白质在人体消化中必须降解成小肽才能被人体吸 收和利用。大部分降解成2 3 个氨基酸组成的小肽，在小肠中以完整的形式被人 体吸收，进入体内循环系统，被人体组织利用，或合成人体蛋白，发挥生理作 用。肽的吸收机制与氨基酸完全不同，它是一个c a 2 + 离子浓度或h + 离子浓度电 导而进行的消耗能量的转运过程，不同于肠细胞游离氨基酸的主动运转。近十 年来，科学家还发现，小分子活性多肽运转系统具有耗能低且不易饱和的特点。 人体小肠对肽的吸收速度远远大于对氨基酸的吸收速度。 4 2 材料与方法 4 2 1 实验材料 大豆分离蛋白：山东禹王实业有限公司植物蛋白分公司； 花生分离蛋白：上海百奥特植物蛋白科技有限公司； a l c a l a s ef o o dg r a d e 碱性内切蛋白酶2 4 h 酶活2 4 a u g 诺维信公司； 第4 章小分子肽的应用 n e u t r a s e 中性蛋白酶o 81 - 酶活0 8a u g 诺维信公司； f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶1 0 0 0h 酶活1 0 0 0l a p u g 诺维信公司； 4 2 2 试剂 n a o h ( 食品级) ，h c l ( 食品级) ，蜂蜜、香精、蔗糖、n a c l 、柠檬酸，山 梨酸钾 4 2 3 主要仪器与设备 表3 2 实验仪器与设备 t a b l e3 2 e x p e r i m e n ti n s t r u m e n ta n de q u i p m e n t s 仪器设备名称产地和产家 可倾式带搅拌夹层锅g i i宁波关智堡食品设备制造有限公司 胶体磨j m s 8 0廊坊通h j 机械有限公司 s s n 型三足式离心机张家港市离心机制造厂 m d r 离心喷雾干燥机无锡市现代喷雾干燥设备有限公司 蠕动泵b t 0 0 10 0 m常州市科健蠕动泵厂 高压均质机s l s 上海申鹿均质机有限公司 y g 1 0 m l 易拉瓶自动灌装机上海宏联医药包装设备有限公司 管制口服液瓶上海庄药用包装材料有限公司 微射流均质机m 7 0 0 型美国m i c r o f l u i d i c s 公司 n c j j 一0 2 1 5 0 纳米级超高压均质机廊坊通用机械有限公司 7 5 5 4 9 5 超滤膜分离装置美国b a r m a n t 公司 z d x 3 5 b i 型座式自动电热压力蒸汽灭上海申安医疗器械厂 菌锅 4 2 4 实验方法 4 2 4 1 - r 艺流程图 6 l 第4 章小分子肽的应用 6 2 第4 章小分子肽的应用 4 2 4 2 工艺操作 ( 1 ) 大豆分离蛋白和花生分离蛋白按l ：l 复配，配制浓度为8 9 的溶液， 并调节蛋白溶液的p h 到8 0 ； ( 2 ) 将( 1 ) 所配蛋白溶液先用均质机3 0 m p a 压力预处理一次，再用8 0 m p a 压力动态超高压微射流处理一次； ( 3 ) 将蛋白溶液转入搅拌夹层锅中，并将锅内温度控制在5 8 ，加入3 的酶( 酶按碱性蛋白酶和中性蛋白酶以l ：1 的方式复配) ，水解3 h ； ( 4 ) 将锅内温度降到5 0 。c ，锅内溶液的p h 调节到5 5 ，加入3 的复合风 味酶，并水解3 h ； ( 5 ) 将温度升高到1 0 0 持续1 0 m i n ，灭酶； ( 6 ) 冷却后离心，适当调节p h ； ( 7