（植物学专业论文）重楼属几种植物形态和遗传分化研究.pdf

四川大学硕士学位论文 重楼属几种植物形态和遗传分化研究 植物学专业 研究生张瑞指导教师王丽教授 摘要 重楼屑p a r i s 隶属延龄草科t r i l i j a c e a e , 共有2 4 个种，主要分布在远东 地区的热带及温带地区我国有1 9 个种，主要分布在西南地区本属植物是重要 的中草药，在被子植物系统发育的研究中也有着重大意义本文从两方面对重楼 属植物进行了研究：( 1 ) 同域分布两种重楼植物形态、遗传分化；( 2 ) 黑籽重 楼原变种和无瓣黑籽重楼的形态分化 ( 1 ) 对峨眉山2 种重楼- d 重楼( p a r i sp o l y p h y l l as m i t hv s 口- m i n o r a s f w a n g ) 、黑籽重楼( p a r i st h i b e t i c af r a n c h ) d n a 进行了a f l p ( 扩增的限 制性片段长度多态性) 分析和形态上的差异分析分析结果表明小重楼和黑籽重 楼无论是在形态还是遗传上均有明显差异它们之间已经有了明显的分化 ( 2 ) 对不同生境下黑籽重楼( 只t h i b e t i c av a t t h i b e t i c a ) 和无瓣黑籽重 楼( p a r i s7 丹拍e t i c af r a n c hv a r a p e t a l ah a n d m a z a ) 9 个居群6 7 个体的 1 8 项形态特征结合数量统计方法进行了研究结果表明：黑籽重楼的两个交种 的形态特征在整体水平上表现出分化上的无规律性，郎不同居群的个体常交叉 聚在同一个表征群内，但在同一表征群内，同一居群的多数个体常能聚在一 起，表明变种间在形态上发生了一定程度的分化 关键词：a f l p ；小重楼：黑籽重楼；黑籽重楼原变种；无瓣黑籽重楼；遗传分 化；形态分化 四川大学硕士学位论文 ab s t r a c t t h e r ea l e2 4s p e c i e si nt h eg e n u sp a r i so ff a m i l yt r i u i a c e a ei na l l , 1 9o f w k i c h h a v ed i s t r i b u t i o ni nc h i n a p 口r 话i sd i s t r i b u t e di nt h et e m p e r a t ea n dt r o p i c a lz o n ei n e u r a s i a c h i n ai sa l li m p o r t a n tc e n t r eo fi t sd i s t r i b u t i o n , e s p e c i a u yt h es o u t h w e s to f c h i n a s o m es p e c i e so f p a r i sa r e ：t r a d i t i o n a lc h i n e s cc r u d ed r u g s ，a n du s e dw i d e l y t h e ya r es i g n i f i c a n tf o rp h y l o g e n e t i cr e s e a r c ho f a n g i o s p e r m o u rr e s e a r c hw o r k f o c u s e do nt w oa s p e c t s ：t h eg e n e t i ca n dm o w h o l o g i c a le v i d e n c ef o rs y m p a t r i c s p c c i a t i o np a t t e r no f p 口恼f r o me m e i m o u n t a i na n d a n a l y s e so fm o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n t i a t i o nw i t h i nn i n ep o p u l a t i o n so p 4 r st h i b e a c af r a n c ha n dp a r i st h i b e t i c a f r a n c hv a l a p e t a l ah a n d - - m a z a 0 ) a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( a f l p ) w n gu s e dt oa n a l y z et h e d i f f e r e n t i a t i o no f2n a t u r a ls p e c i e s ( p a r i s p o l y p h y l l as m i t hv a f m i n o r as e w a n g & p a r i st h i b e a c af r a n c h ) o fp a r i so fe m e im o u n t a i n t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a th i g h g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o na n dm o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o no ft h ep 口mt h i b e t i c a f r a n c ha n dp a r i s p o l y p h y u av a r , m i n o r ai na g e o g r a p h i c a lr e g i o n ( 2 ) b yu s i n g t h em e t h o do fn u m e r i c a ls t a t i s t i c s 。t h ea u t h o ns t u d i e d1 8 m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so f6 7i n d i v i d u a l sf r o m9p o p u l a t i o n sf r o md i f f e r e n t h a b i t a t s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eo v e r a l lm o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o no fp 4 廊 t h i b e t i c af r a n c hv a t t h i b e t i c aa n d 凡，话t h i b e t i c af r a n c hv a l a p e t a 缸h a n d m a z a w a ss o m e w h a tu n o r d e r e d t h ei n d i v i d u a l so fd i f f e r e n ts p e c i e sm a yf a l li n t oo n e c l u s t e r ，w h i l ei n d i v i d u a l sw i t h i nt h es a m es p i e sm o s t l yf a l li n t ot h es a m ed u s t e r i ti si n f e r r e dt h a tt h e r ea l ec e r t a i na m o u n t so fm o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o na m o n g s p e c i e s k e yw o r d s ：a f l p ；m o 叩h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n ：g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n ； p 口r i st h i b a i c af r a n c h ；p a r i s p o l y p h y l l av a t m i n o r a ；p a r i st h i b e t i c af r a n c hv a r t h i b e t i c a ：n 廊t h i b e t i c af r a n c hv a l a p e t a l ah a n d - - m a z a 2 四川大学硕士学位论文 前言 1 概述 重楼是延龄草科( t r i l l i a c e a e ) 重楼属( p a r i s ) 植物的统称重楼属植物是 一类极具药用价值的植物在古代， 神农本草经、本草纲目以及植物名 实图考等药典都对重楼的药用价值做了详细的介绍h l ；在现代，重楼是云南 白药等许多中药的主要成分嘲，常用于治疗疔疮肿毒及流行性腮腺炎等疾病 此外，它还有抗癌止血，祛痰抑制细菌等功效【 重楼属是延龄草科的一个重要类群，该属植物为多年生草本，全世界重楼属 共2 4 个种，分布在远东地区的热带及温带地区，其中我国有1 9 种，以西南各 省区居多【1 】我国的重楼属植物种类最多，主要分布于西南，常小片状或零星生 长于林下或林缘其分布区内湿度大，日照少、降水充沛：种间的垂直分布主要 受制于垂直方向的温度变化n 2 重楼的研究进展 迄今为止，许多学者尤箕国内学者对重楼开展了一系列的研究工作主要 包括它的生物学特性、种质资源、药用成分、药理作用、引种栽培和开发利用 等方面 2 i 遗传学研究 从3 0 年代开始就有人进行过重楼植物的细胞学研究迄今为止，重楼除少 数种外均做过细胞学或核型的研究h 8 - 1 1 j 在重楼属的分子遗传学方面，国内外很少有人研究有关重楼植物的遗传多 样性分析的研究，日前仅见于唐荣华及张金渝等人n 13 】的著述中 2 2 重楼的分类 重楼子叶一枚所以是单子叶植物，但它的许多特征又与双子叶植物一样 又因重楼属内不同类群的特征性状常有交叉或重叠，各类型的界限常常模糊不 清，故历史上重楼属的分类系统发生过较多的分歧和争议f r a n c h e t 、h h a r a 、 以及李恒等人对重楼做了比较详细的分类研究，但他们的分类依据以及划分出 来的重楼属分类系统也不太相同【1 4 - i e 3 四川大学硕士学位论文 2 3 重楼的药用成分 普遍认为重楼药用有效成份为皂甙，研究表明从重楼根茎中分离出来的多 糖类物质也是药用的活性成份【1 争- 2 0 2 4 重楼的组织培养、引种驯化及栽培 李运昌、王丽萍、张金渝、袁理春对重楼进行了野生驯化及栽培技术的初 步研究h 剖一2 3 1 ；李群等对重楼的组织培养做了研究 2 4 t 蠲 2 5 重楼的开发利用 重楼作为一种新兴的药用植物具有广泛的开发利用前景重楼主要药用 成分为甾体皂甙，具有止血、止痛、抗肿瘤、免疫调节和抗生孕等多种生理活 性，是云南白药、宫血宁和季德胜蛇药片等多种药物的主要原料，其需求量很 大嘲其中富血宁胶囊是用于妇产科止血、消炎，辅助子宫复旧的有效药物 4 四川大学硬士学位论文 参考文献 1 李恒重楼属植物北京：科学出版社1 9 9 8 2 胡光万，雷立公出自深山的良药重楼植物杂志2 0 0 2 。0 3 ：1 6 3 钟延瑜，舒光明，易尚平四川重楼属药用资源研究生物资源1 9 9 8 ，1 4 ( 5 ) ：2 0 2 - 2 0 6 4 张霄霖，刘月婵重楼的研究与应用中国中医药科技2 0 0 0 ，7 ( 5 ) ：3 4 6 - 3 4 7 5 汤海峰，赵越平，蒋永培重楼属植物的研究概况1 9 9 8 ，2 9 ( 1 2 ) ：8 3 9 - 8 4 3 6 马云淑，桂镜生朱燕等滇产重楼资源及市场情况调查云南中医学院学报1 9 9 7 ， 2 0 ( 2 ) ：2 4 - 2 6 7 罗明华，蛾眉山的重楼属种类分布及一些种年生长特性中药材2 0 0 4 ，2 7 ( 7 ) ：4 7 8 - 4 8 1 8 h a r ah v a r i a t i o ni np a r i sp o l y p h y l as m i t h , w i t hr e f e r e n c et oo t h e ra s i a t i c s p e c i e s ，f a c & j u n i vt o k y o , s e c t 3 ，b o t 1 9 6 9 1 0 ( 1 0 ) ：1 4 1 1 8 0 9 李恒，顾志建，纳海燕重楼属植物的细胞地理学研究植物分类学报1 9 8 8 ， 2 6 ( 1 ) ：卜1 0 1 0 t a k a h a s h i 1 lp o l l e nm o r p h o l o g yi np a r i sa n di t sr e l a t e dg e n e r ab o t m a g t o k y o 1 9 8 4 9 7 ：2 3 3 2 4 5 1 1 韦仲新重楼属花粉形态的研究云南植物研究1 9 8 8 ，1 0 ( 2 ) ：1 4 7 1 5 3 1 2 唐荣华，王丽，唐小为等十一种重楼属植物的i l a p d 分析 j 】，四川大学学报( 自 然科学版) ，2 0 0 3 ，4 0 ( 4 ) ：7 7 8 7 8 2 1 3 张金渝，等，多叶重楼遗传多样性的r a p d 分析 j 】，生物多样性，2 0 0 4 ，1 2 ( 5 ) ：5 1 7 5 2 2 1 4 f r a n c h e t 丸p l a n t a r u ms i n e n s i u m e c l o g es e c u n d a o u rd eb o t 1 8 9 8 1 2 ：1 9 0 - 1 9 1 1 5 f r a n c h e t 丸m o n o g r a p h i ed ug e n e rp a r i s , l l e ms o cp h i l u mc e n t e n ，p a r i s ，1 8 8 8 ， 2 4 ：3 1 9 - 3 2 4 1 6 t a k h t a j a n ，1 9 8 3 ar e v i s i o no fd a i s w a ( t r i l i a c e a e ) b r i t t o n 趣v 0 1 3 5 ： 2 5 5 2 7 0 1 7 k a z e m p o u ro ，s a n dk a w a n o 。s m o l e c u l a rs y s t e m a t i c so ft r i l l i a c e a ei i p h y l o g e n e t i ca n a l y s e so ft r i l l i u ma n di t sa l l i e su s i n gs e q u e n c e so fr b c la n dm a t k g e n eo f c p d n aa n di n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s ( i t s ) o f l 8 s - 2 6 sn u c l e a rr i b o s o m a l d n a p l a n ts p e c i e sb i 0 1 1 9 9 9 ，1 4 ：7 5 - 9 4 5 四川大学硕士学位论文 1 8 s u s a nb f a r m e ra n de d w a r de s c h i l l i n g p h y l o g e n e t i ca n a l y s e so ft r i l l i a c e a e b a s e do nm o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l a rd a t & s y s t e m a t i cb o t a n y 2 0 0 2 。2 7 ( 4 ) ：p p 6 7 4 6 9 2 1 9 王世林，周立刚，李英滇重楼寄生菌的研究微生物学报，1 9 9 9 ，3 9 ( 2 ) ：1 6 0 1 6 3 2 0 陈昌祥，周俊重楼属植物的化学成分重楼属植物( 李恒主编) m 北京：科学出版 社，1 9 9 8 1 5 8 一1 9 6 2 1 袁理春，陈翠。杨丽云等滇重楼根状茎繁殖诱导初报中药材2 0 0 4 ，2 7 ( 7 ) ：4 7 7 2 2 候玉平，胡晓立，沙莎等重楼的繁殖技术研究进展云南大学学报( 自然科学 版) 2 0 0 4 ，2 6 ( 6 a ) ：6 0 6 2 2 3 王丽萍，起学伟一云南重楼野生驯化及栽培技术研究初探 j 中国野生植物资 源，2 0 0 2 ，2 1 ( 1 ) ：6 2 - 6 3 2 4 李群等重楼属植物初代培养过程中无菌培养物的建立 j 四川师范大学学报， 2 0 0 3 ，2 6 ( 6 ) 2 5 张金渝，虞泓，张时刚滇重楼与华重楼的野生驯化和繁殖技术研究 j 】西南农业学 报。2 0 0 4 ，1 7 ( 3 ) 2 6 李绍平，杨斌滇重楼驯化栽培研究初报u 云南农业科技2 0 0 5 ，2 ：2 4 2 7 唐伯平。周开亚，宋大祥核rd n aits 区序列在无脊椎动物分子系统学研究 中的应用2 0 0 2 。3 7 ( 4 ) ：6 7 - 7 4 2 8 陈之端，冯昱译植物系统学进展科学出版社北京1 9 9 8 2 9 k a t o ，l l ，t e r a n c h i ，瓦，u t e c h ，f h a n dk a w a n o ，s m o l e c u l a rs y s t e m a t i c so ft h e t r i l l i a c e a es e n s ul a t oa si n f e r r e df r o mr b c ls e q u e n c ed a t & m 0 1 p h y l o g e n e t e v 0 1 1 9 9 5 。4 ( 2 ) ：1 8 4 - 1 9 3 6 四川大学硕卜学位论文 ； 第一章同域分布两种重楼植物形态、遗传分化 由于重楼属植物均为一个茎，一轮叶，顶生一朵花的中小型草本，形态近 似，种问形态差异主要集中在生殖器官上。由于所采用的常规形态学和生理学性 状文进行分类在很多时候缺乏遗传基础依据，表型特征不稳定的，很容易受环 境因素的影响，故表型特征的分类分歧很大。因此我们有必要从细胞学或者分 子水平对重楼的分类鉴别进行研究 另一方面，自达尔文的物种起源一书出版后，有关同域物种形成一直 为人们争议的焦点，近年来对同域物种形成的研究较热主要集中在动物上，而植 物万砸研究比较少【1 - 3 1 。因此，研究同域分布物种的形态及遗传分化对探讨同域 物种形成有重要意义。 a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是由z a b e a um a r e 和 v o sp i e t e r f 45 j 发展起来的一种检验d n a 多态性的新方法，它结合了r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 和r a p d 的优点。这种标记方 法较其他分子标记有着明显的优越性，如多态性丰富、不受环境影响、用量小、 灵敏度高、快速高效，因此被广泛用于基因分类，种的鉴定、遗传学图构建的 研究【研。 对采于蛾眉山太子坪同域分白的两个种：小重楼( p a r i s p a l y p h y l l a s m i t h p a r m i n o r as e w a n g ) 和黑籽重楼( p a r i st h i b e t i c af r a n c h ) 进行了形态测量和a f l p 分子鉴定，探讨2 种重楼形态和a f l p 的差异，为重楼属植物的同域物种形成提 供遗传学和形态学证据以及为后人对重楼的分类研究提供方法等参考依据。 1 材料和方法 1 1 材料 小重楼pp o l y p h y l k tw 矿m i n o r a 和黑籽重楼pt h i b e t i c a 采集于蛾眉山太子坪 ( 海拔2 7 5 0 米) ，每种采取1 5 株作为a f l p 试验用。叶片均用硅胶干燥。凭证标本 藏于四川大学生命科学学院植物标本室。 1 2 形态学指标及其数据分析方法 选取峨眉山同域分布的小重楼和黑籽重楼的1 8 个形态学指标( 株高、花梗长、 7 稠川大学硕卜学竹论文 叶长、叶宽、萼片长、花瓣长、萼片宽、花药长、花药突出长、柱头长、花丝 长、花瓣宽、叶数、萼片数、花瓣数、花药数、柱头数、花柱的颜色) 进行测 定以上述各形态学指标作为原始数据，j 羽s p s s l 2 0 软件【7 州计算各表型性状的 范圈、平均值、标准差和变异系数c o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n ( ) 、单因素方差分 析、主成分分析。 1 3d n a 提取和a f l p 分析 1 3 1 重楼总d n a 的提取方法 ( i ) c t a b 法：采用m u r r y 等提出的，并经中国科学院植物研究所系统进化与 植物学开放研究实验室改进的方法1 6 1 。 ( 1 ) 取2 9 叶片，用液氮研磨成细粉，将粉末转移到5 0m l 离心管中，加 入1 0m l 预热至6 5 0 c 的2 xc t a b 缓冲液( 1 0 0 m m o 儿p h 8 0 的 i r i s h c i ， 1 4 m m o i l n a c l ，2 0 m m o l l p h 8 0 e d t a ，2 的c t a b ，2 1 3 巯基乙醇) ， 混匀，胃于6 5 0 c 水浴中放置6 0 r a i n ； ( 2 ) 混合物冷至室温后加入等体积的氯仿，异戊醇，8 0 0 0 9 离心1 0 m i n 分 相： ( 3 ) 重复第( 2 ) 步； ( 4 ) 在上清液中 3 1 a 2 3 体积的异丙醇，冕于2 0 0 c 放置3 0 m i n ，室温1 0 0 0 0 9 离心1 0 r a i n 收集沉淀； ( 5 ) 沉淀溶于1 1 0 倍t e 缓冲液，加1 1 0 0 体积的r n a s e a ，3 7 0 c 保温3 0 m i r a ( 6 ) 用等体积的氯仿，异戊醇再抽提一次，在水相中加入l 5 体积1 0 m o l l n h 4 a c ，后加入2 倍体积冰冷的9 5 乙醇，在- 2 0 0 c 放置至少3 0 m i n ； ( 7 ) 室温1 0 0 0 0 9 离心1 0 r a i n 收集沉淀，加入7 0 乙醇洗沉淀将沉淀溶于 r e 缓冲液中 ( 8 ) d n a 浓度和纯度的检测 ( i i ) s d s 法【1 0 l ( 1 ) 取2 9 叶片，在液氮中迅速研磨成细粉状： ( 2 ) 将粉末转移至5 0 m l 离心管中，加入1 6m l 细胞提取液( 1 0 0 m mp h 8 0 t r i s - h c l ：5 m mp h 8 0e d t a ；5 0 0 m mn a c l ：1 2 5 s d s ：l m mb 巯基乙醇) ， 混匀，6 5 0 c 水浴保温3 0 m i n ： 8 四川大学硕士学位论文 ( 3 ) 加入5 m l 5 m k c i 溶液，冰浴3 0 r a i n 后，8 0 0 0 r p m 4 0 c 离心l o m i u ： ( 4 ) 取上清液，加等体积酚氯仿，异戊醇混匀，8 0 0 0 r p m4 0 c 离心l o m i a ； ( 5 ) 取上清夜，加等体积氯仿，异戊醇，8 0 0 0 r p m4 0 c 离心l o m i m ( 6 ) 取上清液，加入2 3 倍体积的异丙醇，静置3 0 m i n ，离心获得沉淀物 用7 0 的乙醇洗3 次后，加入2 0 0 m i t e ( 1 0 m m o f l t f i s h c l ，1i b l n o f l e d t a ) 缓冲液，d n a 溶解后加入瓤i r n a s e ； ( 7 ) d n a 浓度和纯度的检测 1 3 2d n a 质量检测 待测d n a 样液取1 0 u l 稀释2 0 0 倍，在u v - v i ss p e c t r o p h o t o m e t e r ( t u 一1 9 0 1 ) 型紫外分光光度仪上分别测定其在2 6 0 h m 、2 8 0 n m 和2 3 0 h m 处的o d 值取5 u 1 三c o 露 i a s ei 双酶切产物在1 5 的琼脂糖凝胶( 含e s ) 上电泳，用g e n e g e n i u s b i o l m a g i n gs y s t e m 凝胶成像系统照相取5 u l 选择性扩增产物在6 的聚丙烯 酰胺凝胶上电泳，银染后观察 1 3 3 w l _ p 扩增程序 a f l p 反应的基本程序参照v o s s l 和z a b p a u 4 1 的方法。 1 3 3 1d n a 酶切 利用e c o r i 、m s e t 两个限制性内切酶对3 0 份样品d n a 进行双酶切，双 酶切b u f f e r 为y t a n g o t m 酶切反应在2 0 0 u l 的有盖扩增管中，按下列反 应体系进行 酶切反应体系：2 5 u l 加入样品加入体积 b u f f e r m s e i 限制性内切酶 e o o r i 限制性内切酶 基因组d n a ( 5 0 - 2 5 0 n g u 1 ) d d h 2 0 将反应物混匀后，盖上管盖，置3 7 恒温箱保温9 h ，使其中的基因组洲 9 舢蛳 拙呲札 2 虬 “ l l 四川大学硕士学位论文 被完全酶切酶切结束后，将这些酶切产物从3 7 c 恒温箱中取出，再放入7 0 c 的恒温箱中1 5 m i n ，使限制性内切酶失去活性酶切时间做3 h ，6 h ，9 h ，1 2 h 的 比较酶切产物的检测：取5 u l 酶切产物在1 5 琼脂搪上电泳检测，凝胶成像 系统观察成像并记录实验结果 1 3 3 2 连接 接头复性：将m s e i 接头的两条单链分别稀释至5 0 p m o l u l ，等体积混和， e c o r l 接头的两条单链分别稀释至5 p m o l u l ，等体积混和，依次经历：9 5 5 m i n ，6 5 l o m i n , 3 7 l o m i n ，一次循环的反应。 接头连接：连接反应在2 0 0 u l 的有盖扩增管中，按下列反应体系进行。 接头连接体系：2 5 u l 加入样品加入体积 m s e i 接头 e c o r i 接头 t 连接酶缓冲液1 0 x b u f f e r t d n a 连接酶( 3 u u l ) 酶切后的基因组d n a d d h = 0 0 5 u l 0 5 u l 0 5 u l 0 5 u l 2 0 u l 3 u l 总计 2 5 u l 将反应物混匀后，盖上管盖，置1 4 c 恒温箱保温连接过夜。连接产物分一部分 用0 1 x t e 按1 ：1 0 的比例稀释后用来作下一步试验，剩余部分保存在一2 0 冰箱 中备用。 e c o r i 接头的结构是： 5 i 叩c g t a g a c t g c g t a c c c a t c t g a c g c a t g g t t 从一5 m s e l 接头的结构是： 5 _ g a c g a t g a g t c c t g a g t a c t c a g g a c t c a t 一5 1 0 四川大学硕士学位论文 1 3 3 3 预扩增 ( 1 ) 预扩增引物包括三部分：5 一端的核心序列与接头互补，限制性酶切位点的 序列以及3 端的选择性碱基( 1 个) 以下是e c o r i 和m s e i 预扩增引物的组成： 核心序列酶切位点选择性碱基 e 0 0 ：5 - g a c t g c g t a c ca a t t ca - 3 m o o 5 - g a t g a g t c c t g a gt 从c _ 3 用l 对预扩增引物e 0 0 m 0 0 对3 0 份酶切连接产物进行预扩增，扩增反应在 2 0 0 u l 扩增管中，按下列反应体系和反应程序进行 反应体系：2 0 u l 加入样品加入体积 唧0 n ul ) e ( 5 0 n l ) d n t p g ( 1 0 蛐1 ) 1 0 p c rb u f f e r ( 含m g c l 2 ) t a q 聚合酶( s u l ld d d h 2 0 模板d n a 总计2 0 u l ( 2 ) 预扩增程序 反应程序： s t e p l 9 4 s t e p 2 9 4 s t e p 3 5 6 s t e p 4 7 2 s t e p 5 g o t 0 2 s t e p 6 7 2 s t e p 7 4 ( 3 ) 预扩增产物检测 取5 pl 预扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳， 倍后可置4 保存待用。 1 1 2 m i n l m i n l m i n l m i n 2 6c y c l e s 5 m i n 士 将合格预扩增产物稀释1 0 呲呲呲呲她呲呲 l l l 2 o 9 5 四川大学硕士学位论文 1 3 3 4 选择性扩增 将所有样品个体按上述所筛选的最优条件进行酶切、预扩增和选择性扩增 扩增出来的产物可保存在冰箱中或立即进行电泳。 。 ( 1 ) 选择性扩增引物 用4 对引物分别对3 0 份预扩增产物进行选择性扩增，扩增反应在2 0 0 u l 扩增 管中，按下列反应体系和反应程序进行。 反应体系：2 0 u l 加入样品加入体积 e c o r i + a n no l i g o m s e i + a n no l i g o a t p e 0 0 m m 0 1 ) 1 0 x p c rb u f f e r ( 含m g c l 2 ) t a q 聚合酶( s u - l ) d d h 2 0 稀释后的预扩增产物 1 0 u l 1 0 u l o 5 u l 2 o u l 0 2 u l 1 1 3 u l 4 0 u l 总计 2 0 u l 选择性扩增反应程序： s t e p l 9 4 2 m i n s t e p 2 9 4 3 0 s s t e p 36 5 e ( 每循环降温0 7 ) 3 0 s s t e p 4 7 2 1 m i n s t e p 5 g o t 0 21 3c y c l e s s t e p 6 9 4 3 0 s s t e p 7 5 6 3 0 s s t e p 8 7 2 i m i n s t e p 9 g 0 r r 0 62 3c y c l e s s t e p l 0 7 2 2 m i n s t e p l l 4 + o o a f l p 选择性扩增引物包括三部分：5 一端的核心序列与接头互补，限制性 四川大学硕士学位论文 酶切位点的序列，3 一端的选择性碱基以下是e c o r i 和m s e l 引物的组成： 核心序列酶切位点选择性碱基 e c o r i ：5 - g a c t c , c g t a c c从t 1 a n n 一3 m s e l ：5 啪t g a g t c c t g a gt 从 c n n - 3 3 端的碱基数可以为l 、2 或3 个，选择性碱基数的选择与分析的材料的 基因组大小有关，一般来说，基因组较小，适合选用i - - 2 个选择性碱基的引物， 而基因组较大则应选用2 - - 3 个选择性碱基的引物。表1 3 是本研究种采用3 个e c o r l 引物和5 个m s e l 引物的序列 表1 1a f l p 分析所用引物 引物e a a c 引物e a c c 引物e - a c g 引物m - c a c 引物卜c t a 引物m - c t g 引物m - c a t 5 _ g c 1 b c g t a c c a 舯f c a c 一3 5 g a c t g o g t c c a 竹c c c - 3 5 - g a c t g c g t a c c a a 订c 0 铲3 s g 峨g 蝴o a g 嗽砒c 吣 譬弋椭畸t c 吼g 擞地吼 ? 譬 5 - g t g g 1 c r g a g t a c r g 一3 5 i g 帆g 趴c 饥g 贼c 虹苫 ( 2 ) 选择性扩增退火温度的选择 选择性扩增设计了5 5 、5 5 5 c 以及5 6 三个退火温度来进行扩增。 ( 3 ) 选择性扩增引物的筛选 依据表1 1 的引物序列，确定了用于选择性扩增的1 5 个引物组合。在确定 了选择性扩增最适条件后，接下来从1 5 对引物组合中筛选出合适的引物组合。 实验中，并不是每个引物组合都能扩增出丰富条带，需要对这些引物组合进行 筛选。被选出的引物组合至少必须满足两个条件：一是能扩增出丰富而均匀的 带；另一个是扩增出的带要具有一定的多态性 为了筛选出合适的引物组合，采用了两步法进行筛选第一步是用一个个 体的d n a 做模板( 保证筛选引物过程中条件一致) ，用1 5 个引物组合进行选择 性扩增，每个组合做两管相同的p c r ，以避免由于实验操作失误而不能扩增出 产物。扩增结束后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，观察银染结果，记录能 四川大学硕士学位论文 扩增出清晰而均匀的条带的引物组合编号。 经过第一步筛选出的引物组合还需要进行第二次筛选，最终筛选到具有多 态性的引物组合方法如下：分别将8 个居群的每个个体的d n a 取2i l 混合， 用8 个居群的混合d n a 作模板，用第一步筛选得到的引物组合进行选择性扩增， 然后进行电泳检测，选出具有多态性的引物组合。 1 3 3 5 扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝肢电泳分析 ( i ) 制各6 变性聚丙稀酞胺凝胶 a 将长、短玻板用i o n a o h 洗净后，用双蒸水淋洗，无水乙醇擦拭，凉干 b 取i m l0 5 b i n d s i l a n e 涂抹短玻板，2 r e p e l - s i l a n e 涂抹长玻板，涂抹要 均匀，然后将玻板放置1 5 m i n ，即可组装灌胶 c 放边条，两玻璃板左右两边和下端对齐，两边用夹子夹紧，然后用医用胶布 封胶，封好后插入梳子检查紧密度。 d 4 0 丙烯酞胺胶贮存液配制 丙烯酞胺3 8 9甲叉双丙烯酞胺2 9 配成丙烯酞胺：甲叉双丙烯酞胺= 1 9 ：l ，4 c 冰箱保存备用。 e 1 0 0 m l6 丙烯酞胺胶配配制 4 0 丙稀酰胺 1 5 m l1 0x t b el o m l 尿素429 1 0 a p s5 0 0 u l t e h e d1 0 0 u l 加d d h 2 0 至l o o m l ，1 0 a p s 和t e m e d 在灌胶之前加入 f 将封好的玻璃板倾斜3 0 c ，从玻璃板的一角开始灌胶，胶灌好后小心平 推入梳子，不要产生气泡，胶凝2 小时以上 ( ) 预电泳 胶凝好以后，拔去梳子，去除杂质，取下医用胶布，将玻璃板放入电泳槽， 插上固定挡板固定好玻璃板。倒入预热至6 5 的2 0 0 0 m l1x t b e 缓冲液。电泳 条件设定为：功率6 0 w ，电压1 3 0 0 v ，时间3 0m i n ( 大板) 。 ( ) 电泳 a 扩增产物变性：取选择性扩增产物5 u l ，加入等量上样缓冲液( 9 8 甲 酰胺，i o 耻m e d t a ，0 2 5 溴酚蓝) ，9 5 ( 3p c r 仪中处理5 m i n ，使d n a 变性，立即 1 4 鹳大学硕士学位论文 冰浴1 0 r a i n 以上，矾a r k e r 也做相同处理。 b 电泳：预电泳结束后，小心取出梳子，用枪清除气泡和尿素以便冲洗干 净上样孔，梳子插入界面一点，将每个点样孔上样5 7 l ，用l o o b pl a d d e r 作为d n a 分子量m a r k e r 电泳条件设定为：6 0 w 恒功率电泳l h s o m i n 。 ( ) 银梨1 3 , 1 4 】 固定：用剪刀从一角将玻璃板轻轻分开，将凝胶板置于大小约是胶板两倍 的塑料盒内，加入2 l 固定液( 2 0 0 r a l 甲醇，l o m l 冰乙酸，1 7 9 0 m l 水) 中轻轻 晃动3 0m i n ； 漂洗：用双蒸水漂洗3 次，每次3 m i n ； 染色：加入4 9a g n 0 3 ，染色3 0 r a i n ； 漂洗：用双蒸水漂洗，时间不超过l o s ； 氧化：加入2 9k 2 c j 2 0 , ，氧化3 m i n ； 漂洗：用双蒸水漂洗3 次，每次3 m i m 显影：将凝胶板放入新配的2 l 显影液( 6 0 9n a o h ，l o m l 甲醛，1 9 9 0 m i 水) 中，轻轻晃动，直至带纹出现； 定影：m 入2 l 定影液( 1 0 9 6 醋酸，1 9 9 0 m i 水) ，定影3 5 分钟，用2 l 双蒸水 漂洗5 分钟，室温干燥后数码相机照相保存。 1 3 3 6 数据分析 将d n a 条带易于辨认的多态性带记为“1 ”，空缺时记录为0 。从而获得 a f l p 条带的 0 1 矩阵。采用p o p g e n e 分析软件对两个种和每个个体进行遗传参 数分析 1 1 l 。分别计算了多态位点百分率( p p b ，p e r c e n t a g eo fp o l y m o r p h i c b a n d s ) 、多态位点数( n p ，n u m b e r o f p o l y m o r p h i cl o c i ) 采用n t s y s p c 统计 分析软件【坦l ( v e r s i o n2 1 0 ) 进行主成分析 2 结果 2 1d n a 提取的优化 2 i 1 不同部位提取的d n a 比较 一 对重楼的新根、幼叶及成熟叶分别用c r a b 及s d s 两种方法进行提取，测定 其0 d 值并计算出o d 2 6 0 n m o d 2 3 0 n m 以及o d 2 6 0 n m o d 2 8 0 n m 的比值。纯d n a 四大学硕士学位论文 的( 0 d 2 6 0 0 d 2 8 0 ) 应为1 8 ，小于1 6 说明蛋白质、酚等杂质可能未除尽， 大于1 9 则有r n a 存在。而o d 2 6 0 r o d 2 3 0 n m 小于2 0 则有盐及小分子杂质【1 5 1 。 从d n a 的紫外检测结果看，三个部位的d n a o d 2 6 0 n m o d 2 8 0 n m 均在1 6 1 - 9 范围内，而幼叶相对其他部位来说几乎不含蛋白质，i t n a 、盐及小分子杂质。除 c t a b 法提取幼叶的d n a 外，所有d n a 的o d 2 6 0 r l l n o d 2 3 0 n m 值均小于2 0 ，说明 在提取d n a 溶液中残存盐和小分子另一方面幼叶提取的d n a 浓度高于新根及 成熟叶。( 表1 2 ) 表i 2 不同方法、不同部位提取的重楼d n 结果比较 o d 2 6 0 m n 0 d 2 3 0 n t o o d 2 印吡i n ，o d 2 8 0 n m 样液浓度 型! 垫墨! 塑! 里! 【垫量! 塑 新根幼叶成熟叶新根幼叶成熟叶 2 1 2 不同抽提次数及d n a 提取方法的比较 用c t a b 法提取重楼d n a 过程中，用氯仿异戊醇溶液抽提1 次的上清液比 较混浊，需再抽提2 次，但抽的次数最好不要超过3 次，否则所得d n a 会因抽 提时机械剪切力的增加或在室温中所放的时间延长，而得不到清晰、完整的 a f l p 指纹( 图1 2 ，l i n e2 ) 。两种方法抽提3 次的d n a 条带较抽提1 次的明 亮一些( 图i 1 ，l i n e1 ，3 ) 。而两种方法抽提1 次与3 次的d n a 均能得到清 晰、完整的a f l p 指纹( 图1 2 ，l i n el ，3 ，4 ) c r a b 法提取的d n a 量是s d s