（分析化学专业论文）壳聚糖及其衍生物金属配合物的合成、表征和抗菌抗癌性能研究.pdf

上海师范火学硕士学位论文 论文题目：壳聚糖及其衍生物金属配合物的合成、表征和抗菌抗癌性能研究 专业：分析化学 学位申请人：杨自芳 指导教师：何其庄 摘要 本文采用壳聚糖及其衍生物和稀土硝酸盐及过渡金属盐为原料，运用回流冷凝法 和沉淀法，合成了一系列新型的壳聚糖及其衍生物金属配合物c t s f r e ( r e = l a 3 + ，c e 3 + ， c e 4 + p ，n d 3 + , s m ”，e u 3 + , y 3 + , e r 3 + , g d ”；c t s 为壳聚糖及其衍生物) ，并通过红外光谱、 x 射线光电子能谱、x 射线粉末衍射谱、x 射线能谱、拉曼光谱、热重差热分析、透 射电子显微镜、扫描电子显微镜及荧光光谱等对配合物的组成、结构和性质进行了分 析研究。热重差热分析结果表明所合成的配合物均具有较好的热稳定性。通过电镜 照片分析得出所合成的新型配合物都是纳米粒子。 采用培养基扩散法、营养肉汤稀释法、贴膜法及老化试验法对壳聚糖金属配合物 进行抗菌性能研究，实验用菌是具有代表性的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。抗菌实验 结果表明，所合成的配合物对实验用菌都具有较好的抑制作用，属于广谱抗菌剂，具 有良好的抗菌耐久性和长效性，并且配合物对金黄色葡糖球菌的抗菌能力大于对大肠 杆菌的抗菌能力。此外，还对部分配合物进行体外抗癌活性测试研究，实验靶细胞是 人慢性粒细胞性白血病k 5 6 2 细胞。实验中分别应用倒置光显镜、荧光显微镜和透射 电子显微镜等对k 5 6 2 细胞及配合物作用后的细胞进行形态观察研究，运用m t t 法 进行细胞活性检测，利用流式细胞仪检测配合物作用后凋亡细胞率。抗肿瘤实验结果 表明壳寡糖铈配合物对k 5 6 2 肿瘤细胞的生长和增殖有明显的抑制作用，与对照组相 比有显著差异性，抑制率在一定范围内随剂量的增大而提高。 关键词：稀土；壳聚糖；配合物； 抗菌剂；抗癌 论文类型：研究报告 上海师范人学硕十学位论文 t h e s i st o p i c ：s y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o na n db i o a c t i v i t i e so fm e t a lc o m p l e x e sw i t h t h ec h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s d i s i p l i n e ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y a p p l i c a n t ：y a n gz i f a n g s u p e r v i s o r ：h eq i z h u a n g a bs t r a c t t h en o v e lc o m p o u n d so fe a r t hi o n s ( r e = l a 3 + , c e 3 + ，c e 4 + ，a r 3 + ，n d 3 + , s m 3 + ，e u 3 + ，y 3 + ， e r 3 + ，g d 3 + ) w i t ht h ec h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db y f t i r ，t e m ，e d s ，x p s ，x r d ，t g - d t a ，p h o t o l u m i n e s c e n c e ( p l ) ，r a m a na n ds e m t h et e m i m a g ei n d i c a t e dt h a tt h ec o m p o u n d sw e r ec o n s i s t e do fd i s p e r s e dp a r t i c l e sw i t hn a n os i z e t h es t a b i l i t yo fh e a tw a sp r o v e db yt h ed a t ao ft g d t a t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so ft h e c o m p l e x e sw e r ee v a l u a t e db yt h ea g a r - d i f f u s i o n m e t h o d 、m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nm e t h o da n dt h ef i l ma p p l i c a t o rc o a t i n g t h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt e s t so ft h ec o m p l e x e ss h o w e dt h a ta l lt h e s ec o m p l e x e se x h i b i t e d e x c e l l e n ta n t i b a c t e r i a la b i l i t ya g a i n s te s c h e r i c h i ac o l i a n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s a n d t h e c o m p l e x e sw e r ed u r a b l eq u a l i t y t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nw a sa b o u t6 0 “g m l - 1 - 3 5 0l x g m l - 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ea n t i m i c r o b i a ls p e c t r ao ft h ec o m p o u n d sw e r e b r o a d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ye x c e l l e di n d i v i d u a lc h i t o s a n ，h y d r o x y p r o p y lc h i t o s a n ，t h er a r e c o m p o u n d s w eu s e dt h ei n v e r tm i c r o s c o p e ( i m ) ，f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ( f c m ) a n dt e mt o o b s e r v et h ek 5 6 2t u m o rc e l li nt h ee x p e r i m e n t s a l s o ，w eu s e dt h em e t h y lt h i a z o l y l t e t r a z o l i u m ( m t t ) c o l o r i m r i ca n dt h ef l o wc y t o m e t r yt ot e s tt h ea n t i t u m o u re f f e c to ft h e c o m p l e x e sw i t hk 5 6 2t u m o rc e l l t h er e s e a r c hs h o w e dt h a tt h ec o m p l e x e sc a ni n h i b i t k 5 6 2t u m o rc e l l sg r o w t h ，g e n e r a t i o na n di n d u c ea p o p t o s i s a n dt h e r ew a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p s i n h i b i t i o nr a t i oc o u l da c c r e t eb yt h ed o s a g e s i n c r e a s i n g ，a n di th a ds i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hd o s a g eo f t h ec o m p l e x e si nt h e e x p e r i m e n t k e y w o r d s ：r a r ee a r t h ；c h i t o s a n ；c o m p l e x ；a n t i b a c t e r i a la g e n t ；a n t i c a n c e r p a p e rt y p e ：r e s e a r c hr e p o r t t t 上海师范大学硕+ 学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特 别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其 他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢意。 作者签名：镌柏李同期：么形口，9 z 石 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名筢确芳导师签名：彳铲产日期： 7 口o , c 以形 上海师范人学硕十学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 1 引言 第一章文献综述与课题的提出 环境与健康问题是当代人类普遍关注的重大问题。自然界中，许多微生物是人类 及动植物众多疾病的病原体，它们时刻威胁着人类的生存与发展。2 0 0 9 年在墨西哥 引发的“h 1 n 1 ”流感并感染人致死的事件，2 0 0 8 、2 0 0 9 年发生在我国许多地方的“手 口足病 事件，2 0 0 3 年发生在我国那场突如其来的s a r s 病毒全国大面积感染事件， 1 9 9 6 年在日本发生的全国范围的病原性大肠菌0 1 5 7 感染事件，这一切都给人们留 下了许多思考，公共卫生已引起了各国政府和世界人民的高度关注。 肿瘤也是危害人类生命的重大疾病之一。据报道，目前全世界每年癌症死亡人数 高达7 0 0 万，我国肿瘤的死亡率也居高不下。因此随着全球癌症发病率的不断上升， 世界各国都在不断地投入大量的专家和资金进行抗癌药物的研发。充分的研究表明， 人类8 0 以上的癌症是由社会环境因素引起的，为了人类自身的健康发展，改善公 共环境和个人卫生条件已经成为人们的共识。研制高效的抗菌剂、抗癌药物，对环境 的改善和人们健康水平的提高都具有十分重要的意义。 1 2 抗菌剂的研究进展 抗菌剂指一些微生物高度敏感，少量添加到材料中即可赋予材料抗微生物性能的 化学物质。也就是说抗菌剂是能使细菌、真菌等微生物不能发育或能抑制微生物生长 的物质【l 2 】。 1 2 1 抗菌概念 对于能够杀灭或者抑制微生物的材料，人们通常称之为抗菌材料，材料自身具有 抑制或杀灭微生物的功能，通常也叫抗菌性能。 本文中所谓的“抗菌”实际上是指抵抗各种微生物的功能，包括抗细菌、霉菌、 立克次体、真菌甚至病毒等多种微生物，是一种广义抗菌概念( a n t i m i c r o b i a l ) ，比较 准确地说应该叫“抗微生物”功能。在实际应用和操作中，往往还将仅具有抗菌功能 的材料也叫抗菌材料，这是狭义的抗菌概念( a n t i b a c t e r i a ) t 3 1 。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 2 2 抗菌剂的种类 抗菌剂一般包括无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂三种【4 1 。 1 2 2 1 无机抗菌剂 无机抗菌剂主要是利用无机离子( 如银、铜、锌、钛等) 或无机抗菌氧化物来实现 杀菌或抑菌的一类抗菌剂。 无机抗菌剂具有安全性、耐热性、持久性等优点，是纤维、塑料、建材等生活制 品最适宜的抗菌剂品种。不足之处是与天然或人工合成的高分子化合物亲和性、相容 性差，且一般杀菌作用较慢。近几年来被广泛应用于塑料、陶瓷、金属不锈钢等材料， 应用实例从圆珠笔、冰箱等生活用品到电子路板、电子计算机、建材、纺织等各个领 域【5 1 。 1 2 2 2 有机抗菌剂 早期抗菌剂基本都属于有机系列，有机抗菌剂主要成分可分为醇系、酚系、醛系、 酯系、醚系、过氧化物系、环氧化物系、卤素系等。 有机抗菌剂的优点是，除湿杀菌能力强、杀菌即效和抗菌光谱性好，无论是粉状 还是液态，都能比较容易地分散使用，且已开发数十年，技术成熟，价格也相对便宜。 但是它也有诸多的致命弱点，如化学稳定性差、不耐热，遇热、光等容易挥发，难以 实现长效性；在许多高聚物的高温、高压、高剪切加工条件下易分解失效，甚至产生 有毒的分解产物。特别是在塑料中使用时易迁移，导致抗菌寿命短，成本耐引。 1 2 2 3 天然生物抗菌剂 天然抗菌剂是动物、植物中提炼精制的，是人类使用最早的抗菌剂，如埃及金字 塔中木乃伊包裹布使用的树胶就是天然抗菌剂。天然抗菌剂材料研究目前已成为世界 性课题，天然抗菌剂主要是天然动、植物的一些提取物，因来源、提取技术、成本等 条件的限制，其应用推广有一定困难，同时天然抗菌剂存在稳定性差、有色度等问题， 目前国内外还没有将天然抗菌剂应用到涂料方面的报道【5 1 。 1 2 3 抗菌剂的特征 1 2 3 1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度 抗菌效率是抗菌剂最特征的参数之一，抗菌效果可通过抑制微生物发育繁殖的抗 菌剂最小浓度( m i c ) 和杀灭微生物的最小浓度( m b c ) 体现。m i c 表征抗菌剂阻止微生 2 上海师范大学硕： = 学位论文第一章文献综述与课题的提出 物繁殖的能力。能使受试微生物菌株总量减少9 9 9 或9 9 9 以上所需的最低抗菌剂 溶液或浊液的浓度称为m b c ，m b c 表征抗菌剂的杀菌能力。m i c 或m b c 越小，表 明抗菌剂的抗菌效果越好。日本抗菌协会制定的银等无机抗菌剂的自主规格及其抗 菌试验法中规定无机抗菌剂的抗菌性能要求对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的最少抑制 浓度( m i c ) 小于8 0 0 “g m l i z , - s 】。 1 2 - 3 2 抗菌谱 抗菌剂能表现抗菌活性的微生物种类集合称为该抗菌剂的抗菌谱( a n t i m i c r o b i a l s p e c t r u m ) 。能对多种微生物同时表现抗菌活性的抗菌剂称为广谱抗菌剂，只对一种或 少量几种微生物表现抗菌活性的抗菌剂称为特异性抗菌剂【羽。 评价抗菌剂还有以下因素：持久性( a n t i m i c r o b i a ld u r a b i l i t y ) 、加工适应性 ( p r o c e s s i b i l i t y ) 、耐候性( w e a t h e r a b i l i t y ) 、稳定性( s t a b i l i t y ) 、反应惰性( i n e r t i a ) 、安全性 ( s a f e t y ) 【2 1 。 1 3 壳聚糖及其衍生物的结构、性质与研究进展 早在4 0 0 年前，本草纲目中就有螃蟹壳的应用记载，这是甲壳素最早的应用 纪录。1 8 1 1 年，法国h b r a c o n n o t 教授最早分离出甲壳素，他用温热的稀碱处理蘑菇， 得到一些纤维状的残渣，他以为是纤维素，并命名为f u n g i n e ，意思是真菌纤维素。 1 2 年后也就是1 8 2 3 年，另一位法国科学家a o d i e r 从昆虫的翅鞘中分离出同样的物 质，命名为c h i t i n ，即铠甲、信封的意思。1 8 5 9 年法国c r o u g e t 第一次分离出壳聚 糖，命名为c h i t o s a n 。发现甲壳素之后的一个半世纪，甲壳素的研究进展缓慢。2 0 世 纪下半叶，随着对纤维素、蛋白质和甲壳素及其他糖类等生物大分子的研究，有机化 学诞生和发展起来。甲壳素的研究重心也从欧洲转向日本。1 9 7 7 年英国m u z z a r e l l i 教授发起并主持了第一届甲壳素和壳聚糖国际会议，以后每2 年召开一次。随着人类 智慧增长，科技发展，人们发现甲壳素具有纤维素所没有的特性，是目前世界上唯一 含阳离子的可食性动物纤维，也是继蛋白质、糖、脂肪、维生素、矿物质以外的第六 生命要素。在1 9 9 1 年的会议上，美、欧的医学科技界、营养食品研究机构将其誉为 “第六要素”1 6 j 。 我国于1 9 5 2 年开始研究，2 0 世纪9 0 年代是研究的全盛时期，1 9 9 7 年研究开发 课题列入国家科委九五攻关计划，归属8 6 3 计划，2 0 0 0 年前后酶法生产壳寡糖的方法 3 上海师范大学硕+ 学位论文第一章文献综述与课题的提出 被攻克。 甲壳素( c h i t i n ) 广泛存在于自然界唯一的一种含氮碱性多糖类生物性高分子， 主要来源于虾壳、蟹壳、昆虫壳等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官( 例如乌 贼的软骨) ，以及真菌类的细胞壁等。甲壳素壳聚糖是2 1 世纪的生物新材料【6 】， 具有抗菌、抗癌等许多功能性质，且甲壳素壳聚糖是地球上仅次于纤维素的第二大 生物资源，每年地球上自然界生物的合成量可达1 0 0 亿吨，可以说是用之不竭的可再 生生物资源，这无疑给面临全球资源枯竭危机的人类带来了生机。我国是甲壳素资源 大国，开发具有自主知识产权的新技术对我国的国民经济发展具有重要的意义。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 属于氨基取代的葡聚糖，即d ( 1 ，4 ) 一2 氨基2 脱氧d 葡聚糖， 主要由甲壳素脱乙酰基得到，是一种线性多糖，是自然界中唯一带正电荷的一种天然 高分子聚合物。它具有良好的化学物理性能，能拉丝、成膜、制粒，能通过化学改性 改良物化性能，并能和多种物质( 如胆固醇、脂肪、蛋白质、肿瘤细胞、金属离子) 结合，是有前途的功能材料。甲壳素壳聚糖是一种环境友好材料，它具有无毒、无 味、可生物降解的特点，良好的生物相容性，因此可以应用于医用材料、化妆品的保 湿剂、人体血脂吸附剂、食品添加剂、印染助剂、发酵工业、造纸工业、烟草工业、 纺织工业、农业、环境保护和其他日用化学工业等许多领域【】，甚至可直接将壳聚 糖溶液涂布于伤口以保持伤口的无菌状态并促进伤口的愈合【旧】。由于甲壳素的可再生 性，以及人们对天然抗菌材料的重视，随着实验技术、设备的发展，为制备提供壳聚 糖及其衍生物提供了良好的条件。 1 3 1 壳聚糖的结构 甲壳素是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖，其学名是d ( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧d 葡萄糖，是由n 乙酰氨基葡萄糖以p - l ，4 糖苷键缩合而成的。壳 聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，一般而言，n 乙酰基脱去5 5 以上的就可称之为壳聚 糖，或者说能在1 乙酸或者1 盐酸中溶解1 的脱乙酰甲壳素，这种脱乙酰甲壳素 就被称之为壳聚料6 1 ，其分子结构见图1 1 。 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 。融n h 2h 。o 键h 2 c 。 c h 3 c = o 图1 1 壳聚糖的结构 普通壳聚糖的分子量通常在几十万左右，因其水不溶性而限制了应用。低聚合度 的壳聚糖链长约6n m 一6 0 衄，链直径约o 7n m ，具有纳米尺寸即纳米壳聚糖。 纳米壳聚糖在水中有很好的溶解性，并表现出一些特殊的性能，但有关壳聚糖生理活 性的化学本质研究尚待深入开展。 1 3 2 壳聚糖的性质 壳聚糖是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料不同和制备方法不 同，相对分子质量也从几万到数百万不等，可溶于稀的盐酸、硝酸和大多数有机酸， 不溶于水和碱溶液，不溶于稀的硫酸、磷酸。壳聚糖具有很好的吸附性、成膜性、通 透性、成纤性、吸湿性和保湿性。 壳聚糖的糖残基上有两个活性羟基：一个是c 6 位的o h ，一个是c 3 位的o h 。 c 6 位的羟基是一级羟基，从空间构象上来讲，可以较为自由地旋转，位阻也小；而 c 3 位的羟基为二级羟基，空间位阻大一些，不能自由旋转。所以一般情况下，c 6 位 的一o h 反应活性比c 3 位的大。壳聚糖分子链的糖残基上还有氨基，氨原子上的一个 氢具有一定的活性，在适当的条件下也能发生配位反应【6 】。 从分子结构看，壳聚糖是纤维素的衍生物，糖元的2 位为- - n h c o c h 3 或游离的 堋2 ，3 位为仲一o h 和6 位为伯o h ，因而，壳聚糖对过渡金属以及稀土金属离 子甚至碱土金属离子均有极好的络合能力，可制备壳聚糖基金属配合物材料。壳聚糖 基金属配合物材料兼备了壳聚糖及金属离子的种种特性( 如壳聚糖的高分子特性、p h 响应性、良好的生理活性及金属离子的配位作用等) ，并具有一些新的特性( 如人工模 拟酶) ，使得壳聚糖基配合物材料的应用途径大大扩展，可用做酶固定化剂、分离膜、 人工尿素吸附剂、纳米微晶的生长诱导剂、化学催化剂、植物生长调节剂以及金属离 子分离富集剂、抗菌剂等等【6 】。 5 上海师范人学硕士学位论文 第一章文献综述与课题的提出 在不同介质条件下，壳聚糖金属配合物的稳定性有所差异，在酸性条件下，壳聚 糖的- 2 会质子化，生成圳3 + ，打开分子中n 、o 氢键，使壳聚糖的溶解性增强， 造成壳聚糖的流失；在有其他配位能力更强的配体存在时，金属与壳聚糖问的配位键 可能会断开；另一方面，壳聚糖中有能参与配位成键的删2 、一o h 及- h c o c h 3 对各种金属的选择性较低，且所能络合的金属量也相对较低，因此有必要对壳聚糖进 行改性，以改善壳聚糖基配合物对溶液介质的适应性及提高壳聚糖对金属离子的吸附 量及选择性，以优化配合物材料性能。对壳聚糖进行改性可得n ( o 一) 羧甲基壳聚糖、 s c h i f f 碱型壳聚糖、仅一酮戊二酸壳聚搪、n 烷基化壳聚糖、n 一亚甲基壳聚糖、冠醚化 壳聚糖等多种壳聚糖基衍生物，所得衍生物对介质酸碱性的适应能力和对金属离子的 选择性及饱和吸附量都有明显改掣1 1 邯】。 在稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降低，所以，壳聚糖溶 液一般是随配随用【1 8 】。 1 3 3 壳聚糖的研究进展 近几年，随着对壳聚糖特性认识的加深，人们不仅对能够影响壳聚糖抑菌性能的 机理进行了深入的研究，而且也开始应用化学方法对其进行改性，从而使其抑菌性能 扩展，最终达到扩大壳聚糖应用范围的目的。目前，针对影响壳聚糖抑菌性能方面的 研究主要有以下几个方面： 1 3 3 1 分子量对壳聚糖抑菌性能的影响 多数研究认为，寡聚糖和低分子量的壳聚糖的抑菌效果较好，随分子量上升效果 逐渐下降。特别是对大肠杆菌，壳聚糖分子量越小，抑菌作用愈明显。例如：宋献周 等【1 9 】就几种不同分子量的c 【一壳聚糖对几种常见菌( 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草 杆菌、产气荚膜杆菌) 的抑制研究表明，低分子量的0 【一壳聚糖的抑菌效果优于高分子 量的o 【一壳聚糖。夏文水等【2 0 】采用e c o l i 作为试验菌株，测得分子量为1 5 0 0 的低聚壳聚 糖抑菌效果最强。但是，也有一些研究利用不同的试验菌得出结论认为，壳聚糖分子 量较大时，其抑菌能力更强。y o u s o o k s 等【2 1 】报道分子量为4 万的壳聚糖在浓度为0 5 时，对s t a u r e u s 矛i e c o l i 的杀灭率为9 0 0 0 ；分子量为1 8 万的壳聚糖在浓度为5 0 0 p p m 时，对s t a u r e u s 和e c o l i 的杀灭率为1 0 0 ；分子量在3 0 万以下时，壳聚糖对金黄色葡 萄球菌的抑制作用随分子量减小而逐渐减弱。 6 上海师范人学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 3 3 2p h 值对壳聚糖抑菌性能的影响 严钦等【2 2 1 研究认为，壳聚糖因为具有质子化铵，能与细菌带负电荷的细胞膜作 用，干扰细菌细胞膜功能，造成细菌体内细胞质流失，扰乱细胞的正常生理代谢，从 而达到杀菌的目的。而在p h 为中性时，壳寡糖中的氨基没有被质子化，因而不能抑制 细胞的生长，反而是作为一种营养物质被细菌利用。由此可见，通常在微酸性条件下， 壳聚糖具有明显的抑菌作用，但是当p h 值为7 时，壳聚糖不但没有抑菌效果，反而还 有一定的促进细菌生长的作用。 1 3 3 3 晶体形状对壳聚糖抑菌性能的影响 甲壳质有3 种晶型，即a 、p 和丫一壳二糖聚合物，目前，人们对壳聚糖的研究绝大 多是针对0 【晶型，对其他两种研究甚少。蒋霞云等【2 3 1 通过对l , a - - 壳聚糖+ 口1 3 - 壳聚糖 的抑菌性能得出，具有高黏度、高脱乙酰度的b 一壳聚糖的抑菌性能强于0 【一壳聚糖， 从而填补了壳聚糖抑菌性能研究在该方面的空白。 1 3 - 3 4 辐射对壳聚糖抑菌性能的影响 目前，由辐射方法改变壳聚糖的抑菌性研究已经逐步深入进行，分别有金黄色葡 萄球菌、酵母菌等多个菌种被测试，并分别得出了不同的作用效果及不同的作用浓度。 王勇、张成刚掣2 4 】将壳聚糖经6 0 c 0 丫一射线辐射处理后，发现其对金黄色葡萄球菌抑 菌效果最强，比为辐射前增加l o o 倍，且最适作用浓度为0 0 1 。孟玲、张中泽通 过对酵母菌的抑菌试验验证，经辐射处理后壳聚糖的抑菌活性明显增强，并且o 2 9 l 的辐射壳聚糖具有明显的抑菌活性。 1 3 3 5 化学改性对壳聚糖抑菌性能的影响 ( 1 ) 羧甲基化：羧甲基壳聚糖是目前研究的较多一种物质，由于羧甲基化后其水 溶性增强，因此大大拓宽了壳聚糖的应用范围。目前，羧甲基壳聚糖大多被用于食品 保鲜方面。李治等【2 6 1 人经实验证实，羧甲基壳聚糖在羧甲基化度小于0 6 o 8 时，抗 菌性均大于壳聚糖，当羧甲基化度0 3 - - + 0 6 范围内，羧甲基壳聚糖具有较强的抗菌性， 羧甲基化度大于或小于此范围，抗菌性均有所下降。( 2 ) 磺化：壳聚糖上具有较多的 活泼集团，因此较容易进行各类集团的转化与连接。黎碧娜等对磺化壳聚糖的抑菌 性能进行了研究认为，磺化壳聚糖对大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、黑曲霉、假丝 酵母都有抑制作用，并且浓度越高，抑菌效果越好。此外，磺化羟丙基壳聚糖和黄原 酸壳聚糖也具有一定的抑菌性。 7 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 3 3 6 与金属离子的配位 甲壳素和壳聚糖的残基在c 2 上有一个乙酰氨或氨基，在c 3 上有一个羟基，从构象 上说，都是平伏键，这种特殊的结构使得它们对具有一定离子半径的一些金属在一定 的p h 值下具有螯合作用，即甲壳素和壳聚糖是一种天然高分子螯合剂，这无疑拓宽了 壳聚糖的应用领域。研究认为，壳聚糖对过渡金属螯合作用具有很重要的应用价值。 赵玉清掣2 8 】人合成了壳聚糖- - a 9 0 ) ，并对其抑菌性研究认为，壳聚糖一a g ( i ) 对金黄 色葡萄球菌有良好的抑制作用，并且抑菌性能力随配合物中a g 的配位比的增大而增 强。随后，湛学军等人通过与传统的常用烧治制剂硝酸银对比，证明羧甲基壳聚糖银 不仅具有创口愈合和抑菌两种特性，而且其对某些菌类的抑制效果较硝酸银强，同时 可以弥补硝酸银在实际应用中的许多不足之处。可见，壳聚糖与某些金属络合后，会 增加其抑菌性能。 1 3 4 壳聚糖的生理活性和抗菌机理 1 3 4 1 壳聚糖的生理活性 壳聚糖可与d n a 形成稳定的复合物，干扰d n a 聚合酶或r n a 聚合酶的作用， 阻碍d n a 或r n a 的合成，从而抑制细菌和肿瘤细胞的繁殖，起到抗菌抑菌、抑制 肿瘤细胞生长的作用。壳聚糖基金属配合物中的金属离子可进一步与d n a 复合，也 能起到抗菌抑菌、抑制肿瘤细胞生长的作用【2 9 。3 0 】。 1 3 4 2 壳聚糖的抗菌机理 壳聚糖能够抑制微生物生长的物质作用方式主要有以下几种：损伤细胞壁，改变 细胞膜的通透性，使生物活性物质失活( 如酶、蛋白质和核酸分子等) ，干扰微生物 的分解和合成代谢途径等。壳聚糖及其衍生物的抑菌作用随着其自身和环境条件的改 变而呈现出不同的结果，分析其原因，主要有以下几种可能：( 1 ) 高分子量的壳聚糖溶 于酸后，成为一种阳离子型生物絮凝剂，在絮凝过程中使菌体细胞聚沉，高分子链密 集于细菌菌体表面，形成一层高分子膜，影响细菌对营养物质的吸收，阻止代谢废物 的排泄，导致菌体的新陈代谢紊乱，从而起到杀菌和抑菌的作用。( 2 ) 随着分子量的增 大，壳聚糖分子链的卷曲和缠结程度增大，使得有效基团n h 3 + 被包埋在其中，降低 了对菌体的吸附及杀菌能力。( 3 ) 壳聚糖分子量降低，则可以通过渗透作用穿过多孔细 胞壁，尤其是革兰氏阴性菌，细胞壁较薄，交联松散，低分子量壳聚糖进入细菌内部， 上海师范火学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 破坏细胞质中内含物的胶体状态，使其絮凝、变性，细菌无法进行正常的生理活动， 或者直接干扰其带负电荷的遗传物质d n a 和r n a ，抑制细菌的繁殖，导致微生物的 死亡。( 4 ) ! t h 果分子量进一步减少，则有效基团减少，壳聚糖的絮凝能力降低，甚至没 有抗菌能力。通过渗透作用进入细菌细胞后，可能被几丁质酶或壳聚糖酶所降解，从 而作为营养物质而被利用，反而促进了菌体的生长。( 5 ) 壳聚糖的有效基团n h 3 + 可 以与细菌细胞膜上的类脂蛋白质复合物反应，使蛋白质变性，在细胞表面形成一 层高分子膜，改变细胞膜的选择透过性，阻止营养物质向细胞内运输，致使细胞质流 失、细胞质壁分离，从而起到杀菌作用。尤其是革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，结构紧 密，含有丰富的磷壁酸( t e i c h o i ca c i d ) ，形成一个负电荷环境，壳聚糖损坏细胞壁的完 整性，或使细胞壁趋于溶解，直至细胞死亡。( 6 ) 壳聚糖的杀菌作用可以通过提高离子 强度得到增强，主要是环境中的离子干扰壳聚糖形成分子内刚硬的晶体结构，增加溶 解度实现的，但金属离子除外，因为壳聚糖表面的自由氨基基团可以有选择性地螫合 对微生物生长起关键作用的金属离子，尤其是酶的辅助因子，从而抑制微生物的生长 和繁殖，同时也降低有效氨基的含量，从而降低其杀菌能力。( 7 ) 当壳聚糖浓度足够高 时，能够激活部分微生物本身的几丁质酶活性，或使几丁质酶被过分表达，导致对自 身细胞壁几丁质的降解，从而损伤细胞壁【3 卜38 1 。 1 3 5 壳寡糖的抗菌、抗癌活性 壳寡糖( c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，c s o ) ，又称几丁寡糖，学名为p 1 ，4 一寡聚一葡 萄糖胺。壳寡糖通常是由甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖的降解而获得的2 1 0 个 氨基葡萄糖以d 1 ，4 糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖是具有水溶性好、功能 作用大、生物活性高的低分子量产品。壳寡糖在人体内吸收率近1 0 0 ，其功效是壳 聚糖的数十倍，近年来受到研究者的广泛关注。研究表明壳寡糖具有多种优异的生 理功能，能提高机体的免疫，抑制癌肿细胞生长，促进肝脾抗体形成，促进钙及矿 物质的吸收，增殖双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群，清除自由基、降血脂、降血压、 降血糖、调节胆固醇，减肥，预防成人疾病等功能，可应用于医药、功能性食品等领 域 3 9 4 1 1 。 9 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 4 稀土元素及稀土离子的性质 1 4 1 稀土元素 稀土元素( r a r ee a r t h ，简称r e ) ，其特征是内层的4 f 轨道内逐一填充电子，包括 位于元素周期表中i i i b 族的原子序数为5 卜7 1 的1 5 个镧系元素( 镧l a 、铈c e 、镨p r 、 钕n d 、钷p m 、钐s m 、铕e u 、钆g d 、铽t b 、镝d y 、钬h o 、铒e r 、铥t m 、镱y b 、 镥l u ) ，用l n 表示；此外，i i i b 族的钪( 2 1 s c ) 和钇( 3 如这两元素在性质上与镧系元素 化学性质相似，因此人们常把s c 和y 与镧系元素放在一起，统称为稀土元素，用r e 表示，通常认为稀土元素有1 7 种【4 2 1 。稀土元素具有特殊的电子结构，其电子排布 ( i s 2 2 s 2 2 p 6 3 s 2 3 p 6 3 d 1 0 4 s 2 4 p 6 4 d l o ) 4 f o j 4 5 s 2 5 p 6 5 d o 。1 6 s 2 ，它们的外层电子结构基本相同。由 于相同的外层电子决定了它们的共性，故常将这类元素比作“类同位素”。稀土元素 在很多学科中有重要地位，被誉为工农业的“维生素 和2 1 世纪战略性金属。对稀 土元素的研究促进了相关学科的发展，形成了许多分支学科，如稀土生物化学，稀土 化学、稀土材料、稀土物理学等。稀土元素是新材料的宝库和验证结构与性能的理想 模型，还是研究生物活性物质结构的有力工具，为生命科学研究开辟了一片新天地。 稀土元素的独特的电子结构和多种优良的理化性能，为我国储存丰富的稀土资源开发 开拓了广阔前景【4 3 1 。 1 4 2 稀土离子的性质 镧系元素离子属于硬酸，与配体之间的化学键主要是配位键，容易与具有高负电 性的电子给予体硬碱形成配合物。稀土配合物的特征配位原子是氧，所以稀土离 子可与很多含氧的配体如冠醚、酮类化合物、羧酸等生成配合物。稀土离子还能与氮、 硫等原子配位，但配位能力不如氧。因为稀土离子半径较大，当它形成配合物时，配 位数比较高，常见的配位数为8 和9 ，所以只需要较小的能量就能使近邻配体的位置发 生改变，从而导致存在多晶型现象m 】。 由于稀土离子具有独特的电子层结构，优良的理化性质，其中它们的光、电、磁 性质是稀土作为研究含钙等金属蛋白、金属酶及d n a ，r n a 等结构探针的基础【3 0 3 3 1 。 近年米研究发现，利用这些性质合成不同的药物来防治和治疗各种疾病，如合成抗癌、 抗凝血、杀菌、消炎、镇痛以及其它用途的药物【4 5 4 引。 1 0 上海师范火学硕士学位论文第一章文献综述与课题的提出 1 5 课题研究的内容、方案和创新点 纳米壳寡糖、壳聚糖及其衍生物与稀土离子、过渡金属离子、活性小分子配体等 进行再组装，以制备纳米壳聚糖及其衍生物金属配合物，研究其与细菌、癌细胞及 d n a 、r n a 的相互作用，揭示生物体内d n a 、r n a 被破坏的化学本质，为制备广 谱、高效、低毒的新型药物提供理论依据。 壳聚糖重复单元中有羟基和氨基，在不同的反应条件下，可进行o 、n 或n 、 o 位反应，通过分子设计引入新的基团可赋予壳聚糖新的功能性质。 本研究从分子设计的角度，合成和研究新型壳聚糖及其衍生物金属配合物，以及 它们与细菌和k 5 6 2 细胞作用的过程、结果及机理分析，力争提高在应用化学领域中的 理论水平；开发新型纳米壳聚糖及其衍生物金属配合物功能材料，尤其是丌展具有抗 癌、防霉、抗菌等纳米环境与健康材料的研制与应用研究。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰 基的产物，而甲壳素是一种天然高分子多糖，是仅次于纤维素的第二大类天然高分子， 且我国资源丰富，产量大。近年来壳聚糖在各个领域如化工、环境保护等方面中的运 用受到很大的重视；稀土也是我国丰产资源，由于其独特的结构特点，具有很好的理 化性能；充分利用二者的优点，合成具有抗菌抗癌活性的化合物，为有效开发自然资 源提供一条途径。 本论文拟采取的技术路线： 上海师范入学硕士学位论文第二章合成实验部分 第二章合成实验部分 随着人们对生活质量要求的不断提高，降低有害细菌对人类生活的影响和危害， 预防和治疗癌症，逐渐成为社会的共识，因此人们对于新型、高效的抗菌剂、抗癌药 物的需求日益强烈。壳聚糖具有良好的化学物理性能，能拉丝、成膜、制粒，能通过 化学改性改良物化性能，并能和多种物质结合，是一种很有前途的功能材料。研究发 现壳聚糖具有抗菌性和有良好的生物相容性，而且无毒副作用，因此可以应用于许多 领域。稀土和一些过渡金属元素( 如银、铜、锌等) 具有很好的生物活性。 实验部分利用壳聚糖及其衍生物分子链中存在的羟基、氨基和少量的n 乙酰氨基 及其他活性基团，与稀土离子配位作用，再掺杂银、铜、锌等离子，合成一系列的新 型配合物。本章采用回流冷凝法和沉淀法首次合成了多种新型的壳聚糖及其衍生物金 属配合物。 2 1 实验主要试剂和仪器 2 1 1 实验试剂 本文合成实验及抗菌抗癌测试实验采用的主要原料与药品的名称、规格、纯度和 产地均列于表2 1 中。 表2 1 主要原料与药品的名称、纯度和厂家 名称纯度厂家 壳聚糖( c t s ) 壳寡糖 丙酮 浓盐酸 冰醋酸 硝酸 氢氧化钠 异丙醇 环氧丙烷 硝酸铈铵 硝酸镧 氯化镧 脱乙酰度9 0 脱乙酰度9 0 a r a r c p a r a r a r c p a r a r a r 1 2 浙江金壳生物化学有限公司 浙江金壳生物化学有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海试剂一厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海振兴化工一厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海三浦化工有限公司 上海师范人学硕士学位论文第二章合成实验部分 2 1 2 实验仪器 美国m a t t s o n 公司p k 一6 0 0 0 0 型f t - 瓜红外光谱仪( k b r 压片，摄谱范围4 0 0 0 4 0 0 c m 1 ) ； 日本j e o l 公司j e m 1 2 0 0 e x 型透射电子显微镜，带有锂漂移r 硅s i ( l i ) x 射线能谱仪； 日本r i g a k u 公司型号为d m a x 2 2 0 0x 射线衍射仪； 日本u l v a c p h i 公司的型号为p h i5 0 0 0v e r s ap r o b ex 射线光电子能谱仪； 美国p e r k i n e l m e r 公司型号为p y r i sd i a m o n dt g d t a 型热分析仪； 法国d i l o r 公司s u p e rl a b r a mi i 型共焦显微激光拉曼系统( 双光栅1 8 0 0 和6 0 0 ) 的光谱 仪，1 0 2 4 2 5 6 液氮冷却型c c d 检测器，h e n e 气体激光器) 采得，分辨率2c m ； 美国v a r i a n 公司c a r y - e c l i p s e5 0 0 荧光光谱仪( 用6 5w 的氙灯做激发光源) ，狭缝宽 度为5n l n ： 日本h i t a c h i 公司$ 4 8 0 0 型扫描电子显微镜； 上海师范大学硕十学位论文 第二章合成实验部分 日本尼康公司型号p h a s e c o n t r a s t _ 2e l w d0 3 倒置光显微镜； f o r m as c i e n t i f i c 公司c 0 2w a t e rj a c k e t e di n c u b a t o rs e r i e si i 细胞c 0 2 培养箱 r 本o l m p u sp m 1 0 a d 公司荧光显微镜； 美国c o s t a r 公司9 6 孔细胞培养板； 奥地利t e c a n 公司酶标仪； a u t o s c i e n c ei n s t r u m e n tc o a s 312 0 b 超声分散仪； 美国b e c t o nd i c k i n s o n 公司f a c s c a l i b u r 流式细胞仪，使用氩离子激光器c l a s s l l l b ( 美 国光谱物理公司) ，激光功率1 5 m w ，激光波长4 8 8 m ；b d 公司c e l l q u e s t 软件处理数 据( 由中科院上海细胞研究所提供) ； 博迅实业有限公司恒温细菌培养箱； 常州市国华电器有限公司h j 多头磁力加热搅拌器； 安泰技术有限公司超净工作台； 鼎国生物技术有限责任公司微量移液器； 上海市实验仪器厂，试管、培养皿。 2 2 试剂的配制 2 2 1 6 m o l l 的盐酸溶液的配制 用移液管量取浓盐酸1 2 5 0 m l ，用蒸馏水边稀释边搅拌，转入2 5 0 m l 容量瓶内 用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后移至试剂瓶内待用。 2 2 25 m o l l 氢氧化钠溶液的配制 用分析天平快速称取2 0 0 0 0 9 氢氧化钠固体溶解于少量水中，转入l o o m l 容量瓶 内用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后移至试剂瓶内待用。 2 2 3 1 醋酸溶液的配制 用微量移液器移取冰醋酸l m l 至烧杯中，用少量水稀释后，转入1 0 0 m l 容量瓶 内用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后移至试剂瓶内待用。 2 2 4 饱和碳酸钠溶液的配制 用分析天平称取无水碳酸钠2 0 0 0 0 9 溶于l o o m l 水中形成溶液，然后加入过量无 水碳酸钠，使形成饱和溶液( 2 5 。c ) ，搅匀后移至试剂瓶内待用。 2 2 5p b s 溶液的配制 1 4 上海师范人学硕士学位论文第二章合成实验部分 精确称取8 0 0 0 9 氯化钠( n a c l ) ，0 2 0 0 9 氯化钾( k c l ) ，1 4 4 0 9 磷酸氢二钠( n a e h p 0 4 ) ， 0 2 4 0 0 9 磷酸二氢钾( k h 2 p