（作物遗传育种专业论文）玉米多叶性状基因Lfy的定位研究.pdf

扬州大学硕十学位论文 4 本文所用缩略词及中文对照 l f y l e a f y多叶的 a f l p a m p l i f i c a t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 b p b a s ep a i r碱基对 c m c e n t m o r g a n厘摩 d n a d c o x y r i b o s en u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d n t p s d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t c s脱氧核糖三磷酸 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 f 旦f o r w a r dp r i m e r前部引物 i l p r e v e r sp r i m e r反向引物 h g ih u m a ng e n o m ei n i t i a t i v e人类基因组计划 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 q t lq u a n t i t a t i v et r a i tl o c u s数量性状基因座位 f l y l e a f yo f a r a b i d o p s i sn拟南芥花分生组织转化基因 f l o f l o r i c a l l l ao f a n t i r r h i n u m金鱼草开花调控基因 r f ld e ef l o l f yh o m o l o g s水稻f l o l f y 同源基因 r a p d r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a随机扩增多 态性d n a r f l pr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m限制片段长度多态性 s n p s i n g l en u c l e i d ep o l y m o r p h i s m单核苷酸多念性 s s r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s简单序列重复 s t s s e q u e n c e t a gs e t序列标定位点 s d ss o d i u md o d e e y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 t r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e三甲基氨基甲烷 陈梨辉 玉米多n 性状基闪l 6 的定位研究 摘要 玉米种质资源狭窄是我国玉米育种中的突出问题 要使我国的玉米育种和生产 跃上一个新台阶 就必须不断地补充新的种质 扩大对种质资源的利用 本研究中 所用的玉米多叶材科是从美国引进的一种新型种质 是高光效育种的宝贵材料 有 着普通玉米所不具备的特点 穗上时片数多 一般可达g 2 5 叶 叶片上冲 植株 高大 茎秆粗壮 根系发达 为了更好地将这一种质资源利用于青饲青贮玉米的育 种工作 有必要对多叶性状的遗传作进一步的研究 本研究以相同核背景的穗上叶片数为1 6 叶的纯系y 5 3 1 6 l x 穗上叶片数为4 叶 的纯系y 4 l 的f 2 分离群体为研究对象 对多叶性状的遗传规律进行了研究 同 时 根据玉米多叶基因l j 初步分析的结果 对厶纱基因进行了基因定位 结果如 下 1 对f 2 群体穗上叶片数分布进行遗传分析 结果表明 玉米多叶性状属于数量 性状 不是由单个基因控制 也不是由完全等效的多个微效基因共同作用所导致 而是由主效基因和微效基因共同控铆 2 根据珈基因初步定位的结果 在目的基因附近区域共选取1 0 对s s r 标记 在亲本中进行筛选 获得5 对稳定的多态性s s r 引物 它们分别是u m c 一1 3 6 3 u m c l 0 7 1 u m c 2 0 1 2 u m c l 9 7 7 和u m c 2 2 2 4 3 利用上述5 对s s r 引物对f 2 群体的2 5 0 个单株进行分析 结果表明 标记 u m c l 0 7 1 和u m c l 3 6 3 存在连锁 遗传距离为1 9 2 c m 标记u m c l 3 6 3 和u m c 2 0 1 2 存 在连锁 遗传距离为1 6 8 c m 标记u m c 2 0 1 2 和u m c l 9 7 7 位于同一侧 遗传距离为 1 6 2 c m 标记u n m l 9 7 7 和t t m c 2 2 2 4 存在连锁 遗传距离为1 8 8 c m 标记u m c l 3 6 3 和u m c 2 0 1 2 位于多叶性状基因l f v 的两侧 遗传距离分别为4 0 c m 和1 2 g e m 4 采用比较基因组学方法 将s s r 标记u m c l 3 6 3 定位至4 水稻第3 染色体的 a c l 4 4 2 6 区域 该区域存在与水稻叶片发育相关的q t l 据此推测 本研究中进行 定位的五彦基因不仅能影响玉米穗上叶片数与植株高度 而且在延迟玉米叶片衰老 过程中发挥重要作用 关键词 玉米 多对性狄 穗上升片数 场 基因 s s r 标记 扬州人学硕 学位论文2 a b s t r a c t l a c k i n go fg e r m p l a s mr e s o u r c e sw a st h el e a d i n gp r o b l e mo ft h em a i z eb r e e d i n gi n o u rc o u n t r y w es h o u l du n c e a s i n g l ys u p p l yt h en e wg e r m p l a s ma n de x p a n dt om a k e 峨 o ft h eg e r m p l a s m f o rt h i sw ec a nk e e pm a i z eb r e e d i n ga n dp r o d u c t i o nl e a pan e ws t a i r i no u rc o u n t r y i nt h i sr e s e a r c hl e a f ym a i z em a t e r i a li san e w t y p eo fg e r m p l a s md e r i v e d f r o mu s aw i t hah i g hp h o t o s y n t h e s i se f f i c i e n c y l e a f ym a i z eh a d8t o2 5l e a v e sa b o v e t h ee a r a n db e t t e rs t a l ks t r e n g t hm u c ht a l l e rt h a nn o n l e a f ym a i z ea n dm o r ef l o u r i s h i n g r o o t t h e i rs t a l kw a ss t a l w a r t t h e i rr e s i s t a n c ew a ss 仃o n g f o rl e a f ym a i z eh a dm o r et h a n 2 0l e a v e sa b o v et h ee a r i th a dc h a r a c t e r i s t i cw h i c ht h eo r d i n a r ym a i z ed i dn o th a v e i n o r d e rt ou s e sw e l lt h i si d i o p l a s mr e s o u r c e s i ti sn e c e s s a r yt os t u d yh e r e d i t yo fl e a f yt r a i t f 2s e p a r a t i o np o p u l a l i o ng e n e r a t e df r o mi n b r e dl i n ey 5 3 1 6 l c r o s s e dy 5 3 4 l w a s u s e di nt h i ss t u d y t h en u m b e ri nb r a c k e t sr e p r e s e n t e dt h el e a fn u m b e ra b o v et h ee a r t h i ss t u d ya i m e da tt h ef i n e m a p p i n go fl g e n ew h i c hc o n t r o l st h em a i z el e a fn u m b e r a b o v et h ee a r b a s e do nt h ep r i m a r ya n a l y s i sr e s u l t so f 珈g e n e w es e l e c t e ds s r m a r k e r sn e a rt h et a r g e tg e n ef o rm a p p i n ga n dl i n k a g ea n a l y s i so f 助g e n e t h er e s u l t s w e r ed e s c r i b e di nd e t a i la sf o l l o w i n g 1 a n a l y s i so fl e a fn u m b e ra b o v et h ee a ri nf 2p o p u l a t i o n t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e l e a f yt r a i tw a st h eq u a n t i t a t i v ec h a r a c t e r i s t i c t h el e a f yt r a i tw a sc o n t r o l l e db ym a j o r g e n e sa n dm i n o rg e n e s i tw a sn o tb yt h es i m p l eg e n e a l s ow a sn o tt o g e t h e rb yt h e c o m p l e t e l ye q u i v a l e n tm i n o rg e n e s 2 s s rp r i m e rs e l e c t i o n a c c o r d i n gt ot h ep r i m a r ym a p p i n gr e s u l t so f 珈g e n e t h i s s t u d ys e l e c t e dt e np a i r so fs s rm a r k e r sn e a rt h et a r g e tg e n ef o rf i n em a p p i n g t o t a l l y t h e r ew e r ef i v ep a i r so fs s rp r i m e r s t h a tw a su m e l 3 6 3 u m c l 0 7 1 u m c 2 0 1 2 u m c l 9 7 7 a n du m e 2 2 2 4s h o w i n gp o l y m o r p h i s mb e t w e e nt w op a r e n tl i n e s 3 l i n k a g ea n a l y s i so fs s rm a r k e r sa n d 劬g e n e m a r k e ru m c l 0 7 1w a sl i n k e d v i t h m a r k e ru m c l 3 6 3 t h eg e n e t i cd i s t a n c ew a s1 9 2c m m a r k e ru m c l 3 6 3w a sl i n k e dw i t h m a r k e ru m c 2 0 1 2 t h eg e n e t i cd i s t a n c ew a s1 6 8c m m a r k e ru m c l 9 7 7w a sl i n k e dw i t h 陈梨辉 玉米多n i 性状基因厶分的定位研究 3 r 1 一 m a r k e ru m c 2 2 2 4 t h eg e n e t i cd i s t a n c ew f l l8 8c m 1 1 他g e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e n m a r k e r su m c 2 0 1 2a n du m c l 9 7 7w a s1 6 2c m m a r k e r su m c l 3 6 3a n du m c 2 0 1 2w e l e c l o s el i n k e dw i t hl f yg e n e t h eg e n e t i cd i s t a n c ew 够4 o c ma n d12 8 c m r e s p e c t i v e l y 4 b a s e do i lt h es y n t e n yo fm a i z ea n dr i c e s s rm a r k e rt t m c l 3 6 3w a sl o c a t e di n a c l 4 4 2 6r e g i o ni nc h r3o f r i c e t h e r ew e r es o m eq t l sr e l a t e dt or i c el e a f d e v e l o p m e n l i nt h i sr e g i o n i tm a yb es a f e l yc o n c l u d e dt h a t 珈g e n ep l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nl e a f n u m b e ra b o v et h ee a ra n dp l a n th e i g h ti nm a i z e m o r e o v e r 劬g e n em a yr e g u l a t et h e l e a f d e v e l o p m e n tp r o c e s s i n c l u d i n gl e a f s e n e s c e n c e a m o n go t h e r s k e y w o r d s m a i z e l e a f yt r a i t l e a 黟n u m b e ra b o v et h ee a r 谚g e n e s s rm a r k e r 陈梨辉 玉米多叶性状基因 痧的定位研究 5 一 文献综述 玉米是我国主要农作物之一 但长期以来 玉米种质资源贫乏一直是我国玉 米育种工作中的突出问题 改革开放以来 我国的畜牧业迅猛发展 对饲料的需 求量r 益增加 更突显了饲料玉米种质的欠缺 多叶玉米材料是从美国弓l 进韵一 种新型种质 是商光效育种的宝贵材料 有着普通玉米所不具备的特点 加强对 玉米多叶性状遗传规律的研究 在此基础上培育出高产 优质 多抗的多叶玉米 新品种 可使我国的青饲青贮玉米育种工作迈上一个新台阶 进而促进我国畜牧 业的迅猛发展 l l 多叶玉米的研究进展 1 1 1 多叶玉米的选育 7 0 年代初 美国进行了多叶玉米选育 并建成了多叶玉米群体和转育了一批 优良多叶系 多时型玉米高产组合在7 0 年代束育成 并在参加区域试验中崭露头 角r 相同基因型对比多叶组合产量为1 1 3 8 8 8 k g h a 普通组合为8 8 1 4 k g l h a 增产 2 9 2 8 0 年代初我国丌始收集整理国内外多叶玉米资源 建成多叶玉米群体 并将多叶基因导入骨干普通系 到1 9 9 3 年时已育成穗位上稳定着生7 1 2 片叶玉 米新品系1 2 1 1 1 2 多叶型玉米的形态特征 多叶型玉米其他特征1 2 l f l 茎秆下粗上细 节问下短上长 植株高大木质化 顶部叶片短 夹角小 直立稀疏 功能期较长 当中部叶片衰老时上部叶片仍保 持旺盛功能形成活秆成熟 多苞叶 花丝租 穗大 多穗和多分枝穗 并且有自 身花期不遇 熟期偏晚等特性 子粒为大马齿型 在对籽粒产量要求不太严格的 情况下 多叶玉米材料是很好的青饲青贮玉米种质资源 普通玉米穗上叶数 般 为5 7 张 而多叶玉米的穗上叶片可以达1 2 1 6 张 甚至可达到2 0 张以上 大多 数多叶玉米杂交组合均表现出植株高大 挺拔 抗倒伏的优良性状 而且叶片空 两分布适中 能有效利用光能 合成更多的光合产物 s h a v e r 1 9 8 3 1 4 1 认为多叶玉米是利用控制多叶的基因 调整叶片分布 增加穗 扬州人学硕十学何论文6 位上功能叶片数 p a s s a s l 5 l 的研究指出 多时玉米与普通的玉米在穗下叶片数方 面没有差异 国内外在对多叶材料究竟有多少穗上叶方面的研究存在不一致 b e g n a 等 2 0 0 1 1 6 1 研究的多叶材料穗上叶片数一般比普通型玉米多两张叶片 a n d r e w 2 0 0 0 7 的多叶材料穗上叶片数一般比普通型玉米多六张到八张叶片 h i l l j p a s s a s l 5 1 通过对含上纱 基因的表型研究认为厶彦 主要是影响穗上叶片数 多叶型 玉米比普通玉米的穗上叶片数平均增加八张左右 我校目静玉米种质基因库中的 多叶玉米其穗上叶数最多可达三十多片 目前研究工作中所用的材料其穗上叶片 数一般稳定在9 叶到1 7 升 i 1 3 穗上叶片数与产量 株高的关系 国外有许多学者对多叶玉米与产量的关系进行了研究 3 9 1 0 一2 13 1 认为多 叶型玉米实现了在不增加密度种植的前提下 叶面积指数比普通玉米增加 从而 延长光合时间 加速灌浆速率 最终提高产量 国内对株型与产量关系的研究较多 但只有少数文章中提到叶片数与产量的关 系 曾靖生 1 9 9 5 i 塘过对几个玉米株型性状的遗传规律研究结果表明穗上叶片 数对单株产量有较大的j 下向直接效应 曹靖生 2 0 0 0 l 在利用总配合力效应值确 定玉米种质优势类群的研究中发现穗上叶片数影响光合作用的效能 g y e n e s h e g y i 0 6 1 认为在谚基因影响叶片数 节问长度和植株高度 d i j a k 1 9 9 9 3 1 研究中发现多叶玉米比多叶矮秆玉米的叶片数多 认为控制矮秆的基因r d l 与控 制多叶的基因l f y l 有关系 r d l 减少了t r y l 的表达 当然这种关系受t r y 基因的 限制 c r o s s 1 9 7 3 1 7 也认为株高与叶片数正相关 l 1 4 多叶玉米的遗传特征 s h a v e r 1 9 8 3 t s l 首先提出单显性基因厶纱 能增加额外的穗上叶片数 李长 文 1 9 9 3 1 2 j 认为在遗传性上 普通玉米叶片数是数量遗传性状 虽然通过轮回选 择 经基因积累作用可使穗位上部叶片增加 但其仍然遵循数量性状遗传规律 温海霞 2 0 0 2 1 1 9 经研究认为叶片数的广义遗传率较高 唐雨钊 2 0 0 1 1 3 1 等研 究认为多叶性状是复杂的数量性状 是由两对主基因和多基因共同控制的 陈梨辉玉米多叶在状基冈劬的定位研究 7 h o n g w e ic a i 2 0 0 0 1 2 0 1 秽用n a 4 2 j 下常叶片品种 j a p a n 和9 5 7 l 多叶品 种 c a n a d a 为亲本组配群体 进行场 j 基因的定位 在3 0 0 多个 a f l p s s r 和r f l p 标记中尖现其一个s s r 标记和两个a f l p 标记与五彦 连锁 但没具体 说明位于哪条粱色体及具体标记连锁 f a g o t 1 9 9 5 1 2 i 在实验中检 铡到控制穗上 叶片数性状的基因分别与玉米第一染色体上的五个r f l p 标记 第二染色体上的 两个r f l p 标记 第三条染色体上的两个r f l p 标记 第五条染色体上的三个r f l p 标记 第六染色体上的一个r f l p 标记 第九条染色体上的一个r f l p 标记连锁 据此认为 玉米多叶性状的遗传是由多基因控制的 1 1 5 玉米劬基因与拟南芥劬基因的比较 p a s s a s l 5 1 通过对含玉米l t j l 基因的表型研究认为玉米l 6 1 主要是影响穗上叶 片数 并且在研究中发现 玉米丘彦 植株的侧部发育正常 但顶端分生组织保持 营养生长时间比普通植株长 同时 玉米五彦 基因与早开花的性状不连锁 说明 它们有着不同的发尘途径 国外学者对拟南芥的l e a f y l 彦 基因的研究比较早也比较多 m o d a r r e s 1 9 9 7 m l 认为拟南芥l e a f y 幼 基因是一个花分生组织特征基因 控制拟南芥花序梢鞘分 尘组织向花分尘组织转变 而植物中花分生组织特征基因的结构和功能具有较大 的保守性 2 2 2 3 2 4 2 卯 最近的研究表明 2 9 拟南芬互疹编码了一个发育刀 关 其活 性足以将所有侧梢转变成单花芽 而诱导植株提早开花 霍恩 h a u g h n 韦格尔 w e i g e l 和瓦莱 h u a l a 1 2 习对拟南芥 n 突变体的研究表明 营养生长期拟南芥 l f y 突变体与野生型没有差别 而在生殖生长期 拟南芥l f y 突变体主要表现为 花分生组织不能形成正常的花 而是在应该长花部位形成假次级花序 这些花序 被叶状结构或苞叶所包围 而且愈靠近顶端形成的花序愈具备花的特性 原位杂 交结果显示在突变体植株中拟南芥 f y 的同源物在某一时期的营养分生组织与花 分生组织中均有表达 在营养分生组织中的早期表达不足以导致花序分生组织向 花分生组织的转变i 嘲 现已分离克隆的拟南芥 声 y 同源基因有金鱼草f l o t 2 7 j 烟草n f l l 2 3 1 花椰菜 b o f h l 2 4 水稻r f l l 2 2 辐射松n e e d l y 2 7 1 蓝桉e l f i 与e l f 2 i z 3 i 还有一些果 扬州人学硕士学位论文8 树中也存在雏拷贝的拟南芥三 y 同源基因1 2 卯 有关在玉米中分离并克隆出拟南芥的l f y 同源基因的研究 b o m b l i e s 2 0 0 3 在玉米中分离并克隆出拟南芥的三朋7 同源基因j 猡j 与z f l 2 它们分别位于第1 0 和第2 条染色体上 并且实验还证明2 矽j 和z f l 2 的突变体表型在生殖生长期与拟 南芥的l f y 突变体基本相似主要表现为花的变异 这一观点与田淑兰文章中提到 的一到2 6 1 b o m b l i e s 2 0 0 3 2 对玉米z 玎双突变体研究发现 营养生长期玉米z 弦突变 体与野生型没有差别 而在生殖生长期 玉米 第突变体主要表现为雄穗发育不j 下 常 表现为雌雄同位 如雌穗被叶状结构或苞叶所包围 而在愈靠近雄穗顶端形 成的花序愈具备雄穗的特性f 2 q 上述研究表明 尽管在玉米和拟南芥以及其他植物中都用t f y 符号 但在本研 究中 所用的t r y 符号是特指控制玉米穗上叶片数的基因 而在拟南芥以及其他植 物中的珈基因是控制花序梢鞘分生组织向花分生组织转变的基因 1 i 6 多叶玉米材料在青饲青贮玉米选育上的应用 多叶材料的用途有两大方面 一方面可用于改良自交系 将多叶性状通过回交 的方法转移到其它自交系 可以改变这些自交系生长弱势 制种产量低的状况 这 样 不仅会提高制种产量 对下一代的产量贡献也会很大 另一方面用途是用于青 饲青贮玉米的选育 国内对青贮玉米有两种认识 一是指在乳熟期至蜡熟期期间收获包括果穗在内 的整株 k 米调制成饲料 这种认识与国外是 致的 二是指在玉米的成熟期先收获 玉米果穗 然后再收获玉米的茎叶调制成饲料1 2 纠 依据用途不同 可将青贮玉米 分为专用型和兼用型 专用型玉米是指以生产地上部绿色体为主 专用于青贮的饲料 玉米1 3 们 专用型青贮玉米一般不作粮食用 而主要作牲畜的饲料 也称青饲玉米 粮饲兼用玉米较为普遍的定义是指在获得高产量玉米籽粒的同时 又可获得大量畜 禽充分利用的绿色玉米秸秆 在籽粒完全成熟时而叶片仍很繁茂 茎叶绿色成分保 持较高水平 这种类型的玉米既可单独收获籽粒 也可以籽粒与茎秆混合收获后 再贮藏待用 从秸秆饲用效率上看 玉米秸秆绿色对 保持有较高的粗蛋白 辊脂 陈梨辉 玉米多 1 性状基因厶纱的定位研究 9 肪 而根纤维含量较低 青绿的玉米茎叶是畜禽的优良饲料 青绿型玉米秸秆的含 糖量和含水率比较高 可以用来作优质青贮饲料 这类玉米可以从根本上解决玉米 秸秆饲用转化率低的问题 对粗饲料的丌发利用将有突破性进展 依据分孽性强弱 青贮玉米可以划分为分蘖型和单秆型两种类型 分蘖型青贮 毛米分蘖性强 在2 个以上 整株绿色器官产量高 果穗多 青穗比例高 蛋白质 含量高 能有效地提高青贮饲料品质 单秆型青贮玉米基本无分蘖 植株高大 叶 片繁茂 茎秆粗壮 果穗l 一2 个i 州 青饲玉米是世界重要饲料作物 玉米素有 饲 料之王 的美称 在主要牲畜的日粮结构中 玉米所占比例高达5 0 7 0 3 2 1 研究表 弱玉米青贮饲料各种能量相当于玉米籽实的5 1 5 7 而青贮玉米产量相当于籽实 的4 5 倍 在全部养殖业生产用粗饲料中 青贮玉米提供的能量与蛋白质在2 5 左右 是草食家畜 特别是奶业生产领域不可或缺的粗饲料资源 其在高产奶牛同 粮中的比重往往达到7 0 左右水平 世界上畜牧业发达国家 诸如法国 加拿大 英国 荷兰等国家都培育了大量 的饲料专用玉米品种 进行全株青贮 在欧美许多国家中 玉米青贮饲料早已成为 反刍家畜r 粮中主要的有效能量成分和家畜育肥的强化饲料 青贮玉米虽然是上等 饲料 但由于我国的人口占世界的近l 4 而耕地面积仅占世界的l 7 因此 我国 在相当长一段时间内 不可能像畜牧业发达国家那样大面积的种植青贮玉米 而对 于多叶型而苦 从产量性状看 多叶型玉米穗上叶片多 叶面积大 并且植株高大 光合生产率高 具有高产特点 因此将多叶材料用于青饲青贮玉米的选育具有广阔 的前景 1 2 分子标记技术及其研究进展 遗传标记 g e n e t i cm a r k e r s 是鉴别基因组中基因位点 1 0 c u s 的手段 是易 于t 别而可遗传的实体 它是尘物分类学 3 43 5 育种学 遗传学和物种起源与进化 等研究的主要技术指标之一p 哪 传统上一直沿用植物的外部特征特性即形态标记为 遗传标记 生物学研究进入细胞水平后 人们开始研究利用细胞标记 细胞标记是指染 色体核型 3 8 1 染色体的数目 大小 着丝粒位置等 和带型 c 带 g 带 n 带等 随着同工酶技术的发展 又广泛应用了从蛋白质水平反映生物遗传差异的生化标记 扬州大学硕七学位论文 r o 僵这三种标记的数居有限 不能满足种质资源鉴定和育静工作的需要 并且它们有 些是基因表达加工后的产物 其标记易受环境条件和发育阶段等因素的影响 随着分 子生物学及分子克隆技术的发展和完善 诞生了直接从d n a 水平上进行遗传分析的 分子标记1 3 94 0 l 分子标记直接以d n a 的形式 4 2 l 表现 不受环境条件和发育阶段的 影响 标记的数目多多念性高 并且有许多分子标记表现为共显性 能提供完整的遗 传信息 在人类基因组计划 h u m a ng c n o m ei n i t i a t i v e 简称h g l 的推动下 分 子标记的研究与应用得到了迅速的发展 与形态标记 细胞标记和生化标记等遗传标记相比 分子标记有许多特殊的优 点 如无表型效应 不受环境限制和影响等 当然 理想的分子标记应具备以下特 点 遗传多态性高 共显性遗传 信息完整 在基函组中大量存在且分布均 匀 选择中性 稳定性 重复性好 信息量大 分析效率高 检测手段简 单快捷 易于实现自动化 开发成本和使用成本低 随着分子生物学的迅速发展 分子标记技术在玉米育种中也得到了广泛的应 用 例如k e v i n l 8 0 1 1 9 9 4 定位了玉米抗矮花叶病毒 m d m v 基因m d m l 该基因 与u m c 8 5 标记紧密连锁 遗传图距为o 5 c m 在每一轮选择中只需选择含u m c 8 5 杯记的植株 其中9 9 5 的被选株同时携带有目标抗性基因 对于由隐性基因控制 的性状 利用分子标记进行间接选择也极为有利 在转育隐性基因时 可免除每隔 1 2 代做一次测交以确认目的基因存在与否的步骤 转育工作可通过不伽断的回交 完成 因此借助分子标记的选择可大大加快回交育种的进程 应用分子标 庀技术 可以进一步挖掘与玉米高产 优质 高抗有关的基因 从而进行基因的定位 提高 玉米育种的效率 同时运用该技术对玉米抗逆性基因进行精确定位 为这些抗逆基 因的克隆 转化及利用打下良好的基础 为分子标记辅助选择育种提供了条件 加 侠育种进程 目前 已广泛的应用于作物遗传资源及育种研究的分子标记 主要有限制性片 段长度多态性 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 简称r v l v 随机扩增多态 性d n a r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a 简称r a p d 扩增片段长度多态性 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 简称a f l p 微卫星d n a m i e r o s a t e l l i t e 陈梨辉玉米多叶性状基冈跏的定t i 7 研究 d n a 又称简单重复序歹l j s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简称s s r 以及原位杂交 i ns i t u h y b r i d i z a t i o n 等 1 2 1r f l p 标记技术及研究进展 r f l p r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 指限制性片段长度多念性 是 利用放射性同位素 非放射性同位素探针 与转移于支持膜上的植物总d n a t 叠过 限制性酶消化 杂交 通过显示限制性酶切片段的大小 来检测不同遗传位点变异 多 态性 的一种技术 r f l p 的特点是所有生物的检测程序一致 标记数量较大 呈简 单的孟德尔式共显性遗传 利用r f l p 的共显性 可以把纯合体从分离群体中与杂 合体分开 提供单个位点上的较完整的资料 有利于未知基因的定位且操作方便 分子标i 已r f l p 最初用于预测杂种优势和类群 自j 饲用品质的杂种优势研究 后 来人们又将r f l p 转为共显性p c r 标记用于育种上 n e s s m o f 等利用r f l p 标记估测了 5 7 个欧洲玉米自交系的遗传关系 m u m m 等 4 5 1 利用r f l p 标记将参试的玉米自交系 划分为不同的杂种优势群 划分结果基本上与系谱关系一致 用r f l p 可确定自交 系i 日j 的遗传距离 s m i t h 1 9 8 9 i 删利用2 3 0 个r f l p 探针进行了用于配制3 l o 个杂交组 合的3 7 个自交系等位变异研究 结果发现杂交种中的杂和位点的数目 即自交系等位 变异数 与产量的决定系数高达0 8 7 进一步说明根据亲本自交系的等位变异来预 测杂交种的产量足非常有效的 d u d l e y l s l 等研究结果与他的结论相一致 并认为 r f l p 是自交系遗传相似性的最好估计 同时也适合于玉米自交系i 杂优类群的划 分 利用w o r d 方法 依据r f l p 数据将我国玉米自交系分成了6 个优势类群 其中3 个优势类群同美国的类群相似 2 个优势类群却不同于美国的类群 但仍在我国玉 米育种中起着重要的作用 还有热带类群 这为我国玉米杂优类群和杂优模式提供 了有用信息 这些都表明r f l p 的有效性和可行性 1 2 2r a p d 标记技术及研究进展 r a p d r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a 即随机扩增多态性d n a 是用一 系列随机排列的碱基序列为引物对所研究的模板d n a 经p c r 扩增 然后通过琼脂糖 或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 经过溴化乙锭e b 或银染或放射性自显影来检测产物 d n a 多态性 从而可知基因组相应序列的多态性 其特点是不依赖于种属特异性和 扬媸人学硬七学位论文1 2 基因组的结构 合成一套引物可以用于不同生物的基因组分析 基于p c r 技术 分 析程序较简单 所需d n a 的量极少 1 队p d 标记是显性标记 不能用来区别杂合和 纯合摹冈型 只有通过后代f 2 3 1 分离 分析才能得到 r a p d 被广泛用于种质资源 的鉴定和分类 基因的快速定位和遗传作图等 4 7 1 为了能在品种鉴定和种子纯度检验中应用r a id 技术 王玉民等1 4 砌用半粒玉米 种子进行了d n a 提取和r a p d 分析 结果表明 黼标记技术可用于种子纯度和 品种鉴定 还可以辅助进行杂种后代的早代筛选 加速育种进程 为玉米育种及种 f 检验提供了一种可靠 高效的新鉴定手段 刘新芝 1 9 9 7 1 4 9 首次利斥i r a p d 标记 将我国目前推广玉米杂交种的1 5 个主要自交系进行了杂优类群的划分 划分为6 个 类群 r a p d 标记的划分结果与系谱法相一致 并论证r a p d 在类群划分中应用的可 行性 为玉米育种 优势类群构建及杂种优势模式的建立提供了分子水平上的理论 依据阿 i 2 3a f l p 标记技术及研究进展 a f l p a m p l i f i c df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m b p 扩增片断的长度多态性 又 称选择性限制片段扩增标记s r f a 是 种基于p c r 反应的选择性扩增限制性片段的 方法 是出z a b e a n i s o 等人发明的一项技术 基本原理是选择性地扩增t d n a 酶切 片段 出于不同材科d n a 酶切片段存在差异 因而可产生扩增产物的多念性 它是 r f l p 和p c r 相结合的产物 既有r f l p 的可靠性 又有r a p d 的方便性 a f l p 标记 的多念性强 利用放射性标记在变性的聚丙烯酰胺凝胶上一般可检测到1 0 0 1 5 0 个 扩增产物 因而非常适合绘制品种的指纹图谱 t h o m a s 等 2 0 0 0 t 副j 选出了5 1 个主要自交系来代表欧洲早熟硬粒型和马齿型杂 优类群 进行t a f l p 分子标记分析 并用之将自交系归入不同的杂优类群 而后 又将a f l p 标记所表现出的遗传多样性与r f l p a f l p 及系谱数据进行了对照 进一 步证实a f l p 标记不仅可用于自交系的不同杂优类群的划分 而且可用于揭示自交 系问的系谱关系 l 2 4 s s r 标记技术及研究进展 s s r s i m p l es e q u e n c er e p e a t 即简单重复序列 又称微卫星d n a m i c r o s a t e l l i t e 陈梨辉 玉米多叶性状基因z 痧的定位研究 1 3 d n a 短串联重复或称简单序列长度多态性 它是基因组中的二核营酸 三核昔酸 和四核苷酸的简单串联重复d n a 序歹l j t 5 2 1 微卫星d n a 标记具有多态性高的特点 需要的d n a 量很少 比较适合育种工作 理论上s s r 的标记数量是无限的 每个位 点上有许多等位形式 属于共显性 符合孟德尔方式的分离和遗传规律 带型简单 客观明了 既可用于探针 又能通过p c r 快速扩增 s s r 也可以用于基因定位 分 子辅助育种 真假杂交种和种子纯度的鉴定以及物种系统发生 亲缘关系和起源等 研究i j s s r 具有按照盂德尔方式分离 在数量方面没有生物学上的限制 多念性高 实验程序简单等优点 s s r 两端的独特序歹i j 为通过特异引物p c r 扩增s s r 等位基因 提供了摸板 因此 s s r 能够很容易通过p c r 进行分析 在高分辨率的琼脂糖凝胶 或聚丙烯酰胺凝胶上得以检测 它们多表现为共显性 但也有些表现为显性 姗 自 1 9 9 1 年s s r 技术产生以来 被广泛应用于植物基因定位和q t l s 数量性状基因位点 分析 d n a 指纹和品种鉴定 5 5 l 种质资源保存和利j 羽 s s 5 7 1 系谱分析和标记辅助 育种等方面 t f a h i m a 等用2 3 个s s r q l 物对删峪共检测出小麦中的2 3 0 个等位基 因 平均每个w m s 能检测到1 0 个等位基因 此外s s r 可以进行玉米自交系遗传变 异的分析 并能用于杂种优势类群的划分 而且能够把来源不明的自交系划分到相 应的类群 又进一步提出了黄早4 m o l 7 丹3 4 0 及b 3 7 可用于未知材料类群划分的 标准测验种 这是由于它们之 自j 有较大的遗传变异 分别属于不同的类群 将之作 为测验种使用是合理的 具有代表性 s m i t h 等 5 9 j 研究发现 利用1 3 l 对s s r q l 物对 5 8 个玉米自交系的划分类群结果与用r f l p 研究结果相同 1 3 分子标记用于基因定位研究进展 1 3 1 基因定位的概述 基因定位 g e n el o c a t i o n 1 6 06 6 2 1 是遗传研究的重要领域 也是基因克隆和作 物遗传改良的基础 传统的农作物性状基因定位的方法有 三体分析法 相互易位 法 标记基因法等 但这些方法都依赖于基因的表达 受环境影响较大 定位不太 准确 并且标记数目少 定位效率低 近十年来 由于大量分子标记的丌发和利用 以及高密度遗传图谱的成功构建 基因定位有了重大突破 利用分子标记已经定位了 扬州人学硕 中付论文 1 4 许多作物的重要质量性状和数量性状 q t l 位点 进行基因定位的关键环节包括 1 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合 建立作图群体 2 群体中不同植株的 标记基因型的分析 3 标记间连锁群的确定 其中构建分离群体是作图成功的关键 目前基因定位作图的方法概括起来有二种类型 第一种是根据基因 日j 的相对距离直 接将基因定位于染色体上 第二种是根据与基因连锁的分子标记之间的相对距离和 排列顺序 问接地将基因定位于染色体上 前一种基因定位主要有遗传交换定位法 和分子遗传学的染色体步行法 c h r o m o s o m ew a l k i n g 染色体跳跃法 c h r o m o s o m e j u m p i n g 后一种类型的基因定位方法是首先建立分子标记连锁图谱 参照分子标 记在连锁罔谱上的位霄确定与某一分子标记连锁的基因在染色体上的相对位置 分 子标记连锁图谱目前主要有r f l p 图谱 s s r 图谱 a f l p 图谱及r a p d 图谱等 目的基因的定位就是在染色体上寻找与该基因连锁的分子标记 随着r f l p s s r 等分子标记技术的不断发展 许多物种的分子标记图谱逐渐得到充实 遗传作图 工作也在这些物种中得到飞速的发展 一些重要的农作物 包括番茄 玉米 水稻等 的遗传图谱越来越趋于饱和 利用这些高密度的r f l p 遗传图谱 a f l p 遗传图谱 r a p d 遗传图谱 s s r 遗传图谱可以很方便地对新发现的基因进行定位 并找到与 该基因紧密连锁的分子标记 为图位克隆和基因功能研究奠定基础 1 3 2s s r 标记用于基因定位的研究 s s r 重复性好 精确性和有效性高 可将随机p c r 标记沿着染色体锚定在己知 位置 因而可以用作基因定位 y u 等 1 9 9 4 在大豆中找到了与抗大豆花叶病毒基因 r s v 紧密连锁的s s r 标记s m l 7 6 遗传距离为0 5c m 用s m l 7 6 检测了 抗 感 f 2 群体和其他一系列具r s v 等位基因的近等基因系材料 进一步验证r s v 具有多个等 位基因位点嘟 熊立仲等在研究微卫星d n a 在水稻分子标记连锁图上的分布中 共定位了2 8 个微卫星d n a l 6 4 1 k o r z u n 等首先采用细胞遗传学的方法 把小麦的矮 秆基因r h t 8 定位于2 d 染色体上 然后用s s r 标记r h t 8 并分析其分离群体 筛 选出2 个与r h t 8 紧密连锁的s s r 标记 w m s 2 9 6 和w m s 2 6 1 其遗传连锁距离分 别为0 7c m 和1 4 c m l 1 陈梨辉玉米多叶性状基闪珈的定能研究 1 5 1 3 3 基因定位在玉米分子标记辅助选择中的应用 标记辅助选择是基因定位在常规育种中的直接应用 传统的育种方法主要是通 过对杂交后代群体农艺性状的田问观察和考种进行的 因而受环境的影响很大 往 往需要花费很长的对间才能选育出具有良好性状的品种 而且对于积累多个抗性基 因 打破基因问的连锁累赘 以及对于一些难以选择的性状选育 显得没有办法 高密度的分子连锁图谱的构建 则为解决这些常规难题提供了强有力的手段 通过 获得与目标性状紧密连锁的分子标记或精细地定位目标基因 可以有效进行选择 提高育种过程中目的性和预见性 目前基因定位标记辅助