毕业论文-辣椒中黄酮类化合物的纯化工艺及设计.doc

本科生毕业论文（设计） 中文题目 辣椒中黄酮类化合物的纯化工艺及设计 英文题目 Purification Process and Design of Flavonoids in Capsicum annuum 学生姓名 班级 450904 学号 学 院 生物与农业工程学院 专 业 食品科学与工程 指导教师 职称 副教授 目录目 录目 录1摘 要1ABSTRACT2第1章 绪论51.1前言51.2辣椒的概述51.2.1辣椒的种类（简介）及分布51.2.2辣椒的主要化学成分51.2.3辣椒的功能61.2.4辣椒的国内外开发现状71.3黄酮类化合物的研究概况71.3.1黄酮类化合物的结构及种类71.3.2黄酮类化合物的理化性质81.3.3黄酮类化合物的作用91.3.4黄酮类化合物的应用91.4黄酮类化合物的提取方法101.4.1水提法101.4.2有机溶剂提取法101.4.3超声波提取法101.4.4超临界流体萃取法101.4.5碱性水或碱性稀醇提取法111.4.6其他方法111.5黄酮类化合物的纯化方法111.5.1膜滤111.5.2超速离心111.5.3双水相分离技术111.5.4分子烙印技术111.5.5大孔树脂吸附121.6研究存在的问题及展望121.7本文研究的主要内容12第2章 辣椒果皮中黄酮类化合物的提取152.1材料、试剂和仪器152.1.1材料和试剂152.1.2主要仪器152.2试验方法152.2.1原材料的处理152.2.2微波辅助乙醇提取法152.2.3黄酮类化合物的测定162.3结果与分析172.3.1标准曲线的绘制172.3.2辣椒果皮中黄酮类化合物提取率的测定17第3章 辣椒果皮中黄酮类化合物的纯化工艺研究193.1材料、试剂和仪器193.1.1材料和试剂193.1.2主要仪器193.2试验方法203.2.1辣椒皮黄酮类化合物的提取与粗提液的前处理203.2.2大孔树脂的预处理203.2.3辣椒果皮中黄酮类化合物含量的测定203.2.4大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态吸附率的测定203.2.5大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态解析率的测定203.2.6动态吸附曲线的制作213.2.7动态解析曲线的制作213.2.8单因素试验213.2.9响应面优化试验223.3结果与分析233.3.1大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态吸附率的测定233.3.2大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态解析率的测定233.3.3动态吸附曲线的制作233.3.4动态解析曲线的制作243.3.5大孔吸附树脂静态吸附率与动态吸附率的比较253.3.6大孔吸附树脂静态解析率与动态解析率的比较253.3.7单因素试验263.3.8响应面优化试验303.3.9最佳工艺条件的预测与检验343.4小结35第4章 结论374.1结论374.2讨论37致 谢39参考文献41摘要摘 要辣椒是茄科辣椒属植物，为一年或多年生草本植物，具有药食同源的特点，主要作为烹饪用香辛料应用在日常生活中。近年来还把辣椒作为保健类物质的提取原料来使用，如：从辣椒中提取辣椒碱和辣椒红色素等。目前国内外已有许多关于从植物中提纯黄酮类化合物的研究，但对于辣椒中黄酮类化合物的提取、纯化和利用则鲜有报道。因此，本文以辣椒为研究对象，主要对辣椒中黄酮类化合物的提纯条件进行探索，并对其纯化工艺进行设计。通过对辣椒中黄酮类化合物的纯化工艺的设计，为开发利用我国的辣椒黄酮资源提供科学依据，同时也为黄酮类化合物的工业化生产以及其在食品工业领域的开发和应用提供理论依据。 本文的主要研究内容及结果如下：（1） 采用微波辅助提取法对辣椒果皮中的黄酮类化合物进行提取，提取条件为：乙醇浓度35%、料液比1:55、微波时间4min、微波功率119W。得到的辣椒果皮中黄酮类化合物的提取率为8.63mg/g。（2） 选择NKA-9型树脂作为纯化辣椒皮黄酮的理想树脂，并对该树脂的纯化工艺参数进行了研究，结果表明在使用NKA-9型树脂纯化辣椒中黄酮类化合物时，其最佳吸附条件为：上样吸附速率为0.59mL/min、上样液pH值5、上样量20mL，此时的辣椒黄酮吸附率可达到72.03%。最佳的洗脱条件为：洗脱速率为1mL/min、用浓度为70%的乙醇溶液作为洗脱剂、洗脱剂用量为50mL，此时的辣椒黄酮洗脱率可达到92.38%。关键词 辣椒 大孔吸附树脂 柱层析 黄酮类化合物 纯化 1AbstractABSTRACTCapsicum annuum is capsicum of Solanaceae,which is annual or perennial herb.It can be used as food and medicine at the same time and mainly as cooking spices applications in daily life.In recent years,Capsicum annuum also used as raw materials for the extraction of health substances.For example:Capsaicin and Paprika Oleoresin.Presently there has been many research of the purification of flavonoids from plants at home and abroad.But for the extraction, purification and utilization of flavonoids from Capsicum annuum are rarely reported.Therefore, this article use Capsicum annuum as the research object,mainly explore the purification conditions of the flavonoids compound in Capsicum annuum and design the purification process.By the designing of purification process of Chili flavonoids,provide a scientific basis for the development and utilization of Chili flavonoids resources in our country,also provide a theoretical basis for flavonoids industrialized production as well as the development and application in the food industry .The main research contents and results are as follows: (1)Using microwave assisted extraction method extract the flavonoids in Capsicum annuum skin.The parameters for extraction are:ethanol concentration 35%,ratio of solid to liquid 1:55 and microwave power at 119W for 4min.The extraction rate of flavonoids from Capsicum annuum skin is 8.63mg/g. (2)Choose NKA-9 resin as the ideal resin for the purification of Capsicum annuum skin flavonoids and the resin purification process parameters were studied.The results show that using NKA-9 resin for purification of flavonoids in Capsicum annuum,the best adsorption conditions are:Sample adsorption rate 0.59 mL/min,pH value of the sample 5 and sample volume 20mL,Capsicum annuum flavonoids adsorption rate can reach 72.03% at this condition.The optimal elution conditions are:the elution rate 1 mL/min,the ethanol solution at a concentration of 50% as the eluent and the eluent used in an amount of 50mL,Capsicum annuum flavonoids elution rate can be achieved as high as 92.38%.Keywords Capsicum annuum Macroporous resin Column chromatography Flavonoids Purification43第1章 绪论第1章 绪论1.1前言 随着科学技术的日益发展，工业合成的化学制剂因具有更好的效果而被广泛使用，但这些化学制剂的长期使用产生了许多不良后果。如：耐药性的转移、药物的毒副作用和食品药品安全问题等。因此，人们对绿色、无污染产品的需求越来越大，这就使得人们开始探究从植物中提取一些可用于医药或食品领域的天然化学物质曹晓.辣椒提取物的工艺条件优化及其抑菌活性研究D.河南：河南大学，2008.。 辣椒是人们餐桌上必不可少的调味品之一，辣椒中含有多种对人体有益的化学成分，黄酮类化合物就是辣椒中一类功能价值和经济价值很高的化学物质，现在已被广泛的使用在医药、食品等轻化工业。1.2辣椒的概述1.2.1辣椒的种类（简介）及分布辣椒（Capsicum annuum），又称番椒、海椒和秦椒等，是茄科辣椒属一年或多年生草本植物。果实通常呈圆锥形或长圆形，未成熟时呈绿色，成熟后变成鲜红色、黄色或紫色，以红色最为常见。 辣椒原产于南美洲的墨西哥，17世纪传入我国，是我国仅次于白菜的第二大蔬菜作物，福建小米椒、江南羊角椒、河南樱椒和山东大红椒等，都是我国的特色辣椒品种。辣椒现已成为世界上仅次于豆类和番茄的第三大蔬菜作物，在世界范围内广泛种植G.F.Barbero,A.Liazid,M.Palma,C.G.Barroso.Ultrasound-assisted extraction of capsaicinoids from peppersJ.ScienceDirect,2008,75:1332-1337.。在全球温带、热带和亚热带地区均有种植，尤其在中国、美国和印度等国种植较多张西露，毛亦卉，向拉蛟.国内外辣椒产业研究开发的现状分析J.辣椒杂志(季刊)，2008，（01）：1-5.。1.2.2辣椒的主要化学成分 辣椒中不仅含有脂肪油和挥发油等油脂类成分，还含有辣椒素、辣椒红素、胡萝卜素、类胡萝卜、素叶黄素、维生素、蛋白质、戊聚糖和多种矿物质赖晓英，贺稚非，吴丽红.辣椒的研究及开发现状J.中国调味品，2006，（03）：4-13.。辣椒的辣味成分主要有辣椒素、二氢辣椒素Sinsupha Chuichulcherm,Somprattana Prommakort,Penjit Srinophakun, Anusith Thanapimmetha.Optimization of capsaicin purification from Capsicum frutescens Linn. with column chromatography using Taguchi designJIndustrial Crops and Products,2013, 44 :473-479.、壬酸香兰基酰胺和癸酸香兰基酰胺等。1.2.2.1辣椒红色素辣椒红色素是辣椒中含有的天然红色素，它是维生素A的前体化合物。辣椒红色素是目前使用最广泛的天然食品着色剂之一，广泛用于食品、化妆品和保健品中徐小万，李颖，王恒明.中国辣椒工业的现状、发展趋势及对策J.园艺园林科学，2008，24（11）：332-338.。辣椒红色素纯品为深红色液体，无辣味，不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，极性较强，热稳定性好，耐光耐酸碱，无毒副作用，是一种高品质的天然色素。1.2.2.2辣椒碱 辣椒碱是一种含有酚羟基的生物碱，是辣椒碱类化合物中含量最高的一种，俗称辣味素或辣素，是辣椒辛辣味的主要化学成分。辣椒碱的热稳定性好，纯品为白色晶体，不溶于水，能溶于丙酮和石油醚等有机溶剂以及碱溶液。辣椒碱具有镇痛消炎和抑菌防腐等多种生物活性，被广泛的应用于医药、食品、化工和军事领域等方面康雅.辣椒提取物的分离纯化及生物活性研究D.重庆：西南大学，2011.。1.2.2.3辣椒籽油辣椒籽油是从辣椒籽中提取出的油类物质，其中不饱和脂肪酸占总酸的84%-97%。辣椒籽油中还含有20多种矿物质和多种维生素，特别是维生素E含量较高，还有磷脂、色素、固醇和碳氢化合物等有效物质的含量也较高。1.2.2.4-胡萝卜素-胡萝卜素为深紫色晶体或粉末，不溶于水、酸、碱和低级醇，易溶于苯、氯仿和植物油等。-胡萝卜素具有着色和营养的作用，在我国属于国家允许使用的食品添加剂之一。-胡萝卜素是有效的抗氧化剂，能清除人体中的自由基，在防癌抗癌、预防心血管疾病和增强免疫力等方面具有显著作用。1.2.2.5天然抗氧化物质辣椒中抗氧化的有效成分主要是黄酮醇等黄酮类化合物、绿原酸等肉桂酸衍生物和抗氧化维生素等。1.2.3辣椒的功能 辣椒作为食品和药品应用已有几个世纪。我国是最早将辣椒作为药物使用的国家之一，首载于植物名实图考，辣椒性味辛热，具有温中、散寒和健胃等作用江苏新医学院.中药大辞典M.上海：上海科学技术出版社，1997，2570.。除被用作调味品外，辣椒还可以作为具有药用价值的黄酮类化合物、天然的辣椒红色素和用于保健品的辣椒籽油等的提取原材料。辣椒能够促进胃液的分泌，调节胃口；刺激心脏，加快心脏跳动，促进血液循环；降低胆固醇在人体中的含量，预防血栓形成；同时，辣椒还可以防治风湿性关节炎、神经痛和冻疮等病症，刺激人体新陈代谢，消耗多余能量，防止肥胖，清除自由基的作用。1.2.4辣椒的国内外开发现状1.2.4.1辣椒的国内开发现状近年来, 我国在吸收了世界上的新成果、新技术的同时，开发出了许多适应我国生长环境的特有辣椒品种。辣椒品种的改良和创新不断加快, 适于进一步加工的原料辣椒品种逐步增加，其他生食水果型、观赏型、特异环境抗性型和保护地栽培型等辣椒品种也呈现出逐年增长的势头。同时，围绕辣椒中所含有的营养成分和功能物质开展的一系列营养学、食品加工学、医药学以及其他相关领域的综合研究不断地深入。20世纪90年代至今，我国辣椒的生产快速发展。2005年，我国辣椒种植面积已达160万hm2，占全国蔬菜总种植面积的10%，各地基本实现了辣椒的周年供应毛亦卉，向拉蛟.对我国辣椒产业发展对策思考J.辣椒杂志(季刊)，2007，（02）：1-4.。目前我国的辣椒生产已由原来手工作坊式的操作改为现代化工业式的生产，在生产工艺上也采用了先进的科学技术，如：超低温的物料粉碎等。辣椒的销售模式也由原来的干鲜辣椒销售转变为辣椒的深加工销售。辣椒的深加工可以提高辣椒的附加产值，比如：从辣椒中提取的辣椒红色素、黄酮类化合物等高附加值产品，可应用于食品饮料、医药、化妆品和保健品等多个行业，剩下的富含蛋白质、矿物质等多种有益成分的残渣可以再加工成辣椒饼干、辣椒果丹皮等食品，使得辣椒成倍地增值。1.2.4.2辣椒的国外开发现状随着世界对辣椒的需求不断增加，辣椒加工也由初级水平向高附加值综合深加工的方向发展李萌，龙彭年，肖四海.世界辣椒产业经济发展状况与我国的对策思考J.辣椒杂志(季刊)，2010，（04）：1-5.。目前辣椒的深加工已遍及全球，主要集中在亚非和欧美地区，其中美国、印度和西班牙等都是辣椒深加工制品的主要生产国和供应商。国外开发辣椒及其相关产品的企业个数多、规模大，经济实力较强3。公司管理制度和产品的国家标准相对完善，辣椒产业技术含量高，开发能力强，科研、生产和经营环环相扣，设备先进，产品品种多，附加值高，市场竞争力强。1.3黄酮类化合物的研究概况1.3.1黄酮类化合物的结构及种类黄酮类化合物属于多酚类化学物质Abdul Qayoom Laghari,Shahabuddin Memon,Aisha Nelofar, Abdul Hafeez Laghari.Tecomella undulata G. Don: A rich source of flavonoidsJ.Industrial Crops and Products,2013,43:213-217.，泛指两个苯环通过中央三碳链连接而成的一系列化合物，主要包括以黄酮为母核的一类黄色色素、黄酮的同分异构体及其还原产物江超.地锦草总黄酮的提取及质量控制研究D.湖南：湖南农业大学，2008.。黄酮类化合物大致可分类为：黄酮（包括查耳酮、异黄烷酮及茶多酚等）、黄酮醇、异黄酮和黄烷酮等。黄酮类化合物在自然界中分布很广泛，大约20%的植物都含有一定量的黄酮类化合物，如银杏叶、茶叶和辣椒等。1.3.2黄酮类化合物的理化性质1.3.2.1性状黄酮类化合物大部分为结晶固体，少部分为无定形粉末。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类为灰黄黄色；查耳酮为黄色橙黄色；二氢黄酮、二氢黄酮醇和异黄酮类因不具有交叉共扼体系或共扼链短而显微黄色或不显色徐瞾.荷叶中黄酮类化合物的提取、分离纯化工艺及其抗氧化性研究D.湖北：武汉理工大学，2008.。1.3.2.2溶解性黄酮类化合物的溶解性因其结构或存在状态（苷、苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而不同王作昭.笃斯越桔中黄酮类化合物的提取及纯化工艺研究D.吉林：吉林大学，2006.。如：游离的苷元难溶于或不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂及碱性溶液。1.3.2.3酸碱性黄酮类化合物因多具有酚羟基而显酸性，因此可溶于碱性溶液中。酚羟基的数目及位置不同，黄酮类化合物表现出的酸性强弱也不同。此外，黄酮类化合物分子中还存在未共用的孤电子对，因此又表现出一定的碱性，可以与无机酸等生成盐类，但不稳定，遇水即分解。1.3.2.4荧光性 黄酮类化合物多具有强的荧光性，在紫外线照射下呈现亮黄、黄绿、亮蓝或暗棕等颜色丁彩丽.款冬花中黄酮类化合物的提取及纯化工艺研究D.河南：郑州大学，2006.。1.3.2.5还原反应黄酮类化合物可以发生的还原反应有：盐酸一锌粉反应和四氢硼酸酸钠(钾)反应等。其中盐酸一锌粉反应是检验黄酮类化合物是否存在的最常用方法之一。1.3.2.6络合反应黄酮类化合物可以与铝盐或镁盐等生成黄色、具有荧光的络合物，可用于黄酮类化合物的定性定量分析。1.3.3黄酮类化合物的作用1.3.3.1抗氧化作用黄酮类化合物对多种自由基都有清除作用，如：超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基等。除了对自由基具有清除作用，黄酮类化合物还对过氧化氢、猪油的氧化和脂质的过氧化等具有一定的抵抗作用。1.3.3.2保护心血管系统黄酮类化合物具有扩张血管、降压和降低胆固醇等作用，是临床上治疗心血管疾病的常用物质蒙秋霞.小叶锦鸡儿黄酮类化合物研究D.陕西：西北农林科技大学，2005.。如：芦丁、橙皮苷等能降低血管脆性及异常通透性，可防治动脉硬化；银杏总黄酮、葛根素等对心肌缺氧损伤有明显的改善作用等。1.3.3.3抗癌作用黄酮类化合物的抗癌方式一般分为三种。一是通过直接杀灭肿瘤细胞而阻止肿瘤细胞的分裂繁殖；二是通过增强其他物质的活性间接杀死肿瘤细胞；三是减小甚至消除一些化学致癌物的毒性。如：槲皮素、金雀异黄素和蛇葡萄素等能增强机体的免疫功能，保护正常细胞，抑制肿瘤细胞江玲.生物活性非瑟酮和相关黄酮类及其糖苷衍生物的合成研究D.湖南：湖南大学，2009.。1.3.3.4其他作用黄酮类化合物还具有许多其他积极作用，如：保肝作用、抗病毒作用、类激素样功能、免疫调节功能和镇咳平喘功能等。1.3.4黄酮类化合物的应用1.3.4.1医药方面许多研究证实，黄酮类化合物具有明显的抗肿瘤、增强机体的免疫功能等作用，不同的黄酮类化合物对人体的调节作用和调节机制都有所不同。黄酮类化合物是许多中草药的有效成分，被普遍应用于医药领域。如：以银杏叶为原料制成的各种药物制剂，含有大约24%的黄酮类化合物，包括：槲皮素、异鼠李素和山奈酚等，用于治疗智力衰退、脑功能障碍和脑血管疾病等，疗效非常良好12。1.3.4.2食品方面一些药食两用植物中因含有丰富的黄酮类化合物而被开发成许多保健食品。如：利用富含黄酮类化合物的荞麦，生产荞麦营养粉、糖尿病食疗粉、荞麦茶等保健食品张玉.柑桔皮渣中黄酮类化合物的提取分离技术研究D.重庆：西南大学，2010.。从加工过程来看，黄酮类化合物在食品中的应用主要有两种方式。一是将富含黄酮类化合物的原料直接加工成食品，主要以是固体茶、液体饮料和发酵产品等形式出现；二是先从富含黄酮类化合物的原料中提取出黄酮类化合物，再添加到其他原料中加工制成产品，如：将银杏叶中提取出的黄酮类化合物添加到芒果汁中等。某些黄酮类化合物除可以作为营养增强剂外，还可用于防止一些光敏性色素分解。还有一些黄酮类化合物可以用作天然甜味剂和天然色素等，如：二氢黄酮类的柚皮苷，经氢化后可转变为二氢查尔酮，二氢查尔酮具有甜味，其甜度是蔗糖的100倍，可以作为甜味剂使用万明，宋永钢，杨菠.黄酮类化合物的药理作用及其在食品工业中的应用J.食品科技，47-49.。1.3.4.3农业方面黄酮类化合物对于某些农业害虫具有一定的杀伤作用，如：从蝶形花科植物水黄皮中得到的水黄皮素对于某些蛾的幼虫具有杀伤作用；鱼藤酮及其类似物属于异黄酮类，是众所周知的植物杀虫剂，现已实现商业化开发。1.4黄酮类化合物的提取方法1.4.1水提法黄酮类化合物在水中的溶解度会随着羟基的增多而增加，而在有机溶剂中溶解度相应减小，黄酮苷类一般溶解于水或甲醇、乙醇等强极性溶剂王正云.芦笋中黄酮类化合物的提取及纯化工艺的研究D.江苏：扬州大学，2005.。黄酮类化合物有一定的极性，易溶于碱性水而难溶于酸性水，故可用碱性水提取，再将碱性提取液调节成酸性，黄酮类化合物即可沉淀析出。1.4.2有机溶剂提取法 有机溶剂提取法是国内外使用最广泛的方法，使用的有机溶剂主要有甲醇、乙醇、乙醚和乙酸乙酯等。由于乙醇穿透植物细胞的能力强、毒性小、价格便宜、易于回收再利用、因此大多采用乙醇从植物中提取黄酮类化合物贺波.苎麻叶黄酮的提取、分离纯化、结构及抗氧化活性的研究D.湖北：华中农业大学，2010.。有机溶剂提取法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物，常见的方法为冷浸法和回流法等。1.4.3超声波提取法超声波法提取黄酮类化合物是目前比较先进的方法，超声能够破坏植物细胞膜使黄酮类化合物释放并溶出，同时，超声波的热效应使水温基本保持在60，缩短了提取时间，提高了有效成分的提出率和原料的利用率。 1.4.4超临界流体萃取法近年来，超临界流体提取技术(SFE)迅速发展，在天然植物有效成分的提取过程中应用也越来越多。它具有提取效率高、无溶剂残留、活性成分和热不稳定成分不易被破坏等优点。通过改变临界温度和压力就可以达到选择性提取和分离纯化的目的。1.4.5碱性水或碱性稀醇提取法这种方法溶剂消耗少，成本低廉且方法简单。由于黄酮类化合物多具有酚羟基，难溶于酸易溶于碱，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出郭詹菁.洋葱类黄酮的提取及生物活性研究D.福建：福建农林大学，2010.，浸出液经酸化后就会析出黄酮类化合物，要注意的是所用的碱溶液浓度不宜过高。1.4.6其他方法除上述提到的方法外，从植物中提取黄酮类化合物的方法还有酶解法、超滤法、半仿生提取法、双水相提取技术、热压流体萃取法和高压液相提取法等。 1.5黄酮类化合物的纯化方法1.5.1膜滤 膜滤是以选择性透过膜为分离介质，在膜两侧存在的某种推动力（如压力差、浓度差和电位差等）的作用下，原料一侧的组分按照颗粒大小选择性地透过膜，从而达到分离和提纯的目的。膜滤主要包括微滤、超滤、反渗透、电渗析等。膜分离技术的应用范围广、分离效率高、能耗低、热敏性的成分可在常温下操作毛延妮.植物枇杷叶黄酮类化合物提取与抑菌性研究D.福建：福建农林大学，2010.。1.5.2超速离心超速离心指是通过离心机的高速运转，使离心加速度超过重力加速度，从而实现组分分离的方法。这种方法省时省力，有效成分含量高。但超速离心法无法完全去除糖类等杂质。1.5.3双水相分离技术双水相分离技术具有提取率高、条件温和、溶液用量少、操作方便、易于控制和分离迅速等特点，是黄酮类化合物纯化时的一种有效方法。1.5.4分子烙印技术分子烙印技术是用分子烙印聚合物（针对特定的目标分子而人工合成的具有三维结构的高分子聚合物）专一性识别结构相似的某一类目标分子，再将这一类目标分子分离的技术。这种技术专一性好、分离产物较纯、操作条件温和。但这种方法也存在一定局限性，如：目标分子与分子烙印聚合物结合速度较慢等。1.5.5大孔树脂吸附大孔吸附树脂是一类有机高分子聚合物，它具有高度的稳定性和吸附选择性PENG Liang,LI Zhi-min,LU Li-hui.Optimization Research on the Purification of Total Flavonoids from Aurantii immaturus Fructus byMacroporous ResinJ.Medicinal Plant, 2010,1(4):51-57.，不受无机物存在与否的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长。树脂吸附是20世纪70年代发展起来的一种新工艺，具有快速高效、方便灵敏和重现性好等优点。近年来在天然药物有效成分的提取、分离纯化和质量分析与控制等方面得到广泛的应用。 大孔吸附树脂吸附能力较强，具有良好的吸附选择性，用它提取分离中药溶液中的有效成分特别有效，因此大孔吸附树脂主要应用于分离纯化中药皂苷类、生物碱类、黄酮类、多肽类和糖类等成分或极性化合物张建超.地锦草总黄酮提取工艺及部分药理学研究D.湖南：湖南农业大学，2009.。1.6研究存在的问题及展望黄酮类化合物有多种生理功能且不良反应少，有较大的开发应用前景王 慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展J.食品与药品，2010，12（09）：347-350.。现代社会人们保健意识的逐步加强，使得保健行业迅速发展壮大，特别是从植物中提取某些有益成分加工而成的保健品在市场上销售更为紧俏。近年来辣椒的深加工工业正适应了这一趋势，并且已经慢慢改变了传统的辣椒消费结构和形式。黄酮类化合物作为药品资源，广泛应用在食品、化妆品和保健品等行业，其价值被人们日益重视，但目前黄酮类化合物的开发应用主要集中在医疗方面，将其应用在食品中的研究并不多见，尤其是将其作为一种天然食品添加剂的研究就更少了。对于辣椒中的黄酮类化合物，目前研究较为深入的是黄酮类化合物的提取，再应用到其他方面和领域。但由于辣椒中黄酮类化合物的含量有限，且提取时其他杂质含量相对较高，因此，如何改进提取和纯化的工艺技术，改进设备条件，降低生产成本，得到纯度更高的黄酮类化合物，是研究怎样提高辣椒价值的重要课题。综上所述，在辣椒的综合利用和开发上，应该加大对辣椒的深入加工处理，提高辣椒的附加值，因此从辣椒中提取具有高附加值的黄酮类化合物势必成为一个非常有前景和发展空间的课题，对我国辣椒产业将产生深远的影响。 1.7本文研究的主要内容本文以辣椒为原料，主要研究过程为：利用微波辅助和乙醇浸提相结合的方法从辣椒果皮中提取黄酮类化合物；利用柱层析法，将辣椒果皮中黄酮类化合物的粗提液通过大孔吸附树脂进行提纯；最后应用响应曲面法对此纯化工艺进行优化。研究的主要内容有：（1）根据已有文献中给出的辣椒果皮中黄酮类化合物的提取条件，进行黄酮类化合物的粗提取；（2）利用单因素试验分别研究粗提取液pH值、吸附速率、上样量、洗脱剂浓度和洗脱剂用量对辣椒皮中黄酮类化合物吸附率和解析率的影响，初步确定较优的纯化条件。（3）选取对黄酮纯化效果影响较大的三个单因素进行响应曲面优化，最终确定出最佳的辣椒皮中黄酮类化合物的纯化工艺。第2章 辣椒果皮中黄酮类化合物的提取第2章 辣椒果皮中黄酮类化合物的提取 辣椒果皮中黄酮类化合物纯化的基础是黄酮类化合物的提取，其提取是根据相似相溶的原理进行的，实质过程就是黄酮类化合物从植物向溶剂转移的过程，在这一过程中，影响提取的主要因素有溶剂种类、浓度、料液比、原料的粉碎度和辅助方法等。微波辅助萃取（MAE）是指利用微波强化溶剂萃取的效果，即利用微波的热效应来加速溶剂对固体样品中目标萃取物的萃取，该法具有萃取时间短，所得产品杂质含量低和有效成分高等优点张帆，周峰，王桂花，杨屹，郭振库.微波辅助萃取-分光光度法测定卫矛中总黄酮J.光谱学与光谱分析，2008，28（07）：1633-1636.-Gerardo,F.B.,Palma,M.,Barroso,C.G.Determination of capsaicinoidsin peppers by microwave-assisted extraction-high performance liquid chro-matography with fluorescence detectionJ.Anal.Chim.Acta.2006,578:227-233.。本文根据以上理论，采用乙醇作为浸提溶剂，并用微波辅助提取辣椒果皮中的黄酮类化合物。2.1材料、试剂和仪器2.1.1材料和试剂辣椒：牛角椒，购于长春市利民市场；芦丁标准品：天津市光复精细化工研究所；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠：北京化工厂。（化学试剂均为分析纯试剂）2.1.2主要仪器FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；MM721AAU-PW型美的微波炉；JA3003A型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；LD4-2A型低速离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；PH070A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。2.2试验方法2.2.1原材料的处理辣椒去杂、去梗，将皮与籽分离，去籽留皮。将处理好的辣椒皮放入烘箱中，50烘24h，至恒重，然后用粉碎机粉碎，过60目筛，备用。2.2.2微波辅助乙醇提取法在黄酮类化合物的提取过程中，通常使用的溶剂有甲醇、乙醇和丙酮等。考虑到黄酮类化合物的理化性质、溶剂的残留性及毒性、操作的安全性和经济性等因素，选择安全无毒、易挥发、回收方便且价格低廉的乙醇作为辣椒果皮中黄酮类化合物的提取剂。称取1g辣椒皮粉末于250mL烧杯中，按料液比为1:55加入35%的乙醇溶液，搅拌均匀，放入微波炉中进行微波辅助提取（间歇微波、微波功率119W）4min，然后将提取液放入离心机中，在4000r/min的转速下离心5min，取上清液测量体积，最后用定性滤纸将粗提液过滤，滤液备用。2.2.3黄酮类化合物的测定本文采用NaNO2-Al(NO3)3比色法对辣椒果皮中黄酮类化合物的含量进行测定。因为黄酮类化合物与NaNO2-Al(NO3)3反应，在510nm处有最大吸收峰，且吸光度与黄酮类化合物的含量成一定比例关系，因此可以通过测定吸光度值来测定其含量闫琳娜.松针落叶黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化性能分析D.吉林：吉林大学，2009.。2.2.3.1标准曲线的绘制 准确称取2.0mg芦丁标准品，用80%的乙醇溶解并定容到20mL，得到浓度为0.1mg/mL的芦丁标准液。分别吸取0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的芦丁标准液于6个10mL比色管中，依次加入0.5mL5%的NaNO2溶液，摇匀，静置6min；再加入0.5mL10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min；最后加入4mL1mol/L的NaOH溶液，并用80%的乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，静置15-20min。以相应的试剂做空白，在510nm处用玻璃比色皿测定吸光度。根据测定结果，以芦丁标准溶液浓度（x）为横坐标，以吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线。2.2.3.2辣椒果皮中黄酮类化合物提取率的测定 吸取1.0mL已处理好的提取液置于10mL比色管中，按照标准曲线绘制的方法进行测定，以不加提取液的空白比色管作为参比液。辣椒果皮中黄酮类化合物提取率的计算公式为： （2-1） 式中：Y黄酮类化合物的提取率（mg/g）； K稀释倍数； x黄酮类化合物的质量浓度（mg/mL）； V离心后提取液的体积（mL）； M辣椒皮粉的质量（g）。2.3结果与分析2.3.1标准曲线的绘制芦丁标准曲线见图2-1，标准曲线方程为：y=12.21x-0.0027，R2=0.9997，吸光度于芦丁标准溶液浓度在0.01-0.05mg/mL范围内线性关系良好。图2-1 芦丁标准曲线Fig. 2-1 The standard curve of rutin2.3.2辣椒果皮中黄酮类化合物提取率的测定 吸取1.0mL已处理好的提取液置于10mL比色管中，按照标准曲线绘制的方法进行测定，以不加提取液的空白比色管作为参比液。测定吸光度值A为0.200，经过计算，得到辣椒果皮中黄酮类化合物的质量浓度为0.17mg/mL，提取率为8.63mg/g。第3章 辣椒果皮中黄酮类化合物的纯化工艺研究第3章 辣椒果皮中黄酮类化合物的纯化工艺研究在第2章中对辣椒果皮中黄酮类化合物的提取过程进行了阐述，但是通过上述提取过程得到的只是黄酮类化合物的粗提液，其中杂质含量较高，为了提高黄酮类化合物的纯度，就需要对粗提液进行纯化。本试验选取NKA-9型树脂作为纯化辣椒果皮中黄酮类化合物的理想树脂，以辣椒果皮中黄酮类化合物的粗提液为原料，对其在NKA-9型大孔吸附树脂上的静态吸附性能和动态吸附性能分别进行了研究，并对该树脂的纯化工艺参数进行研究，为辣椒中黄酮类化合物的大批量生产打下基础。3.1材料、试剂和仪器3.1.1材料和试剂 辣椒：牛角椒，购于长春市利民市场；NKA-9型树脂：树脂物理性能见表3-1；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、硝酸铝、亚硝酸钠：北京化工厂。（化学试剂均为分析纯试剂） 表3-1 吸附树脂的型号及物理性能Table3-1 Physical property of NKA-9 macroporous resin树脂型号Resin type极性Polarity situation粒径范围(mm)Range ofparticle size(mm)比表面积(m2g-1)Specific surface area(m2g-1)平均孔径(nm)Average pore diameter(nm)空隙率(%)Porosity(%)孔容(mLg-1)Pore volume(mLg-1）NKA-9极性0.3-1.25250-29015.5-16.546-50 注：表示数据不全。3.1.2主要仪器TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SHA-C型水浴恒温振荡器：金坛市恒丰仪器厂；JA3003A型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；PH070A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。3.2试验方法3.2.1辣椒皮黄酮类化合物的提取与粗提液的前处理将辣椒果皮粉末（50下烘干至恒重，粉碎过60目筛）置于烧杯中，用浓度为35%的乙醇作为提取剂，料液比为1:55，微波时间4min（间歇微波、微波功率119W），然后将提取液放入离心机中，在4000r/min的转速下离心5min，取上清液用定性滤纸将粗提液过滤，得到辣椒果皮黄酮类化合物的粗提液，滤液备用。3.2.2大孔树脂的预处理将市售的NKA-9型树脂用95%的乙醇溶液浸泡，30恒温下水浴震荡24 h，待树脂充分溶胀后先用蒸馏水冲洗至无白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味；然后用5%的HCl溶液浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性；最后用5%的NaOH溶液浸泡12 h，再用蒸馏水洗至中性，备用WU Gong-qing,YI Yun-hong,ZOU Mei-qing,TIAN Su-ying1,ZHAO Zeng-yang.Study on the Purification Process of Total Flavonoids from Root of Rosa laevigata Michx. by Macroporous Adsorption ResinJ.Medicinal Plant,2011,2(7):39-41 。3.2.3辣椒果皮中黄酮类化合物含量的测定辣椒果皮中总黄酮的含量采用NaNO2-Al( NO3)3比色法测定（参照第2章）。3.2.4大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态吸附率的测定准确称取预处理并干燥好的树脂1g置于100mL烧杯中。加入总黄酮浓度约为0.17mg/mL的辣椒果皮黄酮粗提液50mL，置于水浴恒温震荡器中，30下低速振荡24h，达到饱和吸附，测定此时溶液中的总黄酮的含量，按照下式计算吸附量(Q)、吸附率(A)。 Q=(C0- Cr)V/W （3-1） A(%)=(C0- Cr)/C0100（3-2）式中：C0起始浓度(mg/mL)； Cr吸附后溶液中总黄酮浓度(mg/mL)； V溶液体积(mL)； W树脂重量(g)。3.2.5大孔树脂对辣椒中黄酮类化合物静态解析率的测定将3.2.4中充分吸附后的树脂用蒸馏水淋洗至树脂表面无黄酮粗提取溶液残留，然后将树脂置于100mL的烧杯中，加入50mL70%的乙醇溶液，置于水浴恒温震荡器中，30下低速振荡解吸24h，测定解吸液中黄酮的浓度，按照下式计算解吸率(D)。 D(%)= (VCr) / (WQ)100（3-3）式中：Q吸附量(mg/g干树脂)； Cr解吸后溶液中总黄酮浓度(mg/mL)； V溶液体积(mL)； W树脂重量(g)。3.2.6动态吸附曲线的制作准确称取1g预处理好的树脂，将树脂用常规的湿法装柱装入玻璃层析柱（1.5cm30cm）中，加入已知浓度的辣椒总黄酮粗提液，控制流速为1 mL/min，每5mL收集一次流出液，测定流出液中黄酮的浓度，直至趋于平衡，停止加样并关闭活塞，以流出液体积（mL）为横坐标，流出液中黄酮类化合物的浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制动态吸附透过曲线，确定最佳吸附时间。 3.2.7动态解析曲线的制作准确称取1g预处理好的树脂，将树脂用常规的湿法装柱装入玻璃层析柱（1.5cm30cm）中，加入已知浓度的辣椒总黄酮粗提取液50mL，控制流速为1 mL/min，在动态条件下使树脂吸附达到饱和，测定其吸附量。用蒸馏水将树脂淋洗至表面无黄酮提取液残留，加入70%的乙醇溶液进行动态洗脱，每5mL收集一次洗脱液，检测洗脱液中黄酮类化合物的浓度，直至趋于平衡，关闭活塞，以流出液体积（mL）为横坐标，流出液中黄酮类化合物的浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制动态解析透过曲线，确定最佳解析时间。3.2.8单因素试验3.2.8.1提取液pH值对吸附效果的影响用1mol/L的HCl溶液或NaOH溶液将辣椒果皮黄酮粗提液的pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0（其中6.0为粗提液的原pH值）。准确称取已处理好的树脂1g，将树脂用常规的湿法装柱。精密加入已调成不同pH值的提取液50mL，控制流速为1mL/min进行动态吸附，待