RAPD实验方案.doc

DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用草坪草的RAPD分子标记一、溶液配制及物品准备所有水均使用超纯水116室，如果没有则用去离子水。1. 配制1 M Tris-HCl (pH8.0) 【100mL】-蓝盖瓶装配方:1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。PH值 浓HCl 7.4 约70ml 7.6 约60ml 8.0 约42ml 4. 将溶液定容至1 L。5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 2. 配EDTA（0.5 mol/l pH8.0）【500mL】-蓝盖瓶装配方: EDTA（0.5 mol/l pH8.0）(1)称取93.06克EDTA2Na2H2O，置于500 mL烧杯中(2)加入约400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌(3)用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml(6)高温高压灭菌后，室温保存EDTA二钠盐难溶，需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时才会溶解。配制时，可以直接将EDTA2Na2H2O和约10g的NaOH （注意约10g，不要一次加到10g，为后面pH微调留下余地）一起加水混合，充分溶解，再微调pH。3. 1TE Buffer 储存液【1L】-烧杯配制，锥形瓶分装分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。配方组份浓度 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA（pH8.0）1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 10mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 2mL2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。3. 将溶液定容至1L。4. 高温高压灭菌，室温保存。将1-3的溶液配好后，再统一灭菌，保存。4. 准备灭菌水（500 mL蓝盖瓶装）1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，普通1.5 mL离心管2盒，普通4 mL离心管2盒，PCR小指管200 l 2盒，灭菌，保存。每次实验完毕后，各小组将灭菌水1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，PCR小指管200 l 2盒，重新装满，灭菌后，放在120南面的实验架上。5. 电泳缓冲液：【随用随配】 5TBE（贮存液/L室温保存）【500mL】 54 g Tris碱 27.5 g硼酸20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 0.5TBE（工作液）注意：实验用药品在天平上方的架子上，其他需要4保存的药品等，放置在120室透明门冰箱最底层。需要-20 保存的药品，染料，引物等在119室1号冰箱下层冷冻室的第一个抽屉中。配好的试剂，如需要存放，写好标签，放在对应冰箱中。用后归位！二、草坪草基因组DNA的提取草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：1. 处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织100 mg 加入液氮充分研磨。加入400 l缓冲液LP1和6 l RNase A（10 mg/ml），漩涡震荡1 min，室温放置10 min。要求：每一大组4种植物，每种提取4份，共16小管。同一种植物可以取1g-1.5g一次研磨，再分成4份，分别处理。2. 加入130 l缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1 min。3. 12000 rpm（13400 g）离心5min，将上清移至新的离心管中。4. 加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇），立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。6. 向吸附柱CB3中加入700 l漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：如果吸附柱呈现绿色，向吸附柱CB中加入500 l无水乙醇，12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7. 重复步骤68. 将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm（13400 g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3助于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验）9. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 l洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000 rpm（13400 g）离心2min，将溶液收集到离心管中。要求：将同种植物的4份混合至1个离心管中，标号，封口处加贴封口膜。放入-20冰箱中长期保存，或者直接进行下一步电泳鉴定。注意事项：1. 检查LP1，LP2是否有沉淀，如有，37水浴化开，或微波十秒左右化开（微波时注意安全，化开即可，可短时多次）2. 研磨样品时，一定要在植物冻住的状态下研磨。如果化开，一定要及时加液氮，切勿在糊状下继续研磨，液氮添加次数至少3次。3. 磨好的样品，转移到每个离心管中不要过多。研磨的是过量的，每个1.5mL离心管中放置相当新鲜时的100mg或略多一点的样品即可。过多裂解不完全，反而提取不出或者效果不佳。三、草坪草基因组DNA提取情况的电泳验证对于已经提取完毕的基因组DNA，需要对其进行TBE凝胶电泳实验来验证提取情况。在电泳实验之前需要制作TBE胶板，每100 ml的药品用量如下：0.7 g Regular Agarose， 100 ml 0.5TBE电泳缓冲液， 7 l GoldView。如需其他用量则按比例添加。1. 称取适量的Regular Agarose至锥形瓶中，加入0.5TBE电泳缓冲液，在微波炉中加热使之溶解。2. 待稍冷却后加入适量GoldView，摇匀。将溶液趁热倒入已经组装好的制胶槽中，待胶板彻底冷却后方可使用。3. 将胶板放入电泳槽中，加入0.5TBE电泳缓冲液直至没过胶板。4. 将草坪草基因组DNA提取液10 l 到离心管中并与1 l Loading Buffer充分混合后逐个加入到胶板的泳道槽中。在第一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的DNA Marker 5 l。最后一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的DNA Marker 10 l。5. 将电泳槽正负极与电泳仪正负极正确相连，注意电泳方向从负极到正极。设定恒定电压为110 V，电泳1 h。6. 取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。要求：配制200mL琼脂糖凝胶，制备4块胶板，6齿梳子。为本次使用，和下一步稀释后再次验证用。如果用11齿的小梳子，则可以少配胶，样品DNA加量为4l，marker也相应减少。四、基因组DNA的定量为方便下一步的RAPD-PCR时的加入的样品剂量符合要求，需要将DNA浓度稀释到约100 ng/l，根据TBE凝胶电泳的条带明暗程度确定相应稀释倍数。1. DNA/ HindIII为0.1mg DNA/mL，加样量10 l，即每样孔1g。对应DNA的量，查下图即可：将电泳结果贴在这里2. 记录稀释倍数物种编号稀释倍数物种编号稀释倍数192103114125136147158163.稀释后，立即电泳再次验证。要求：每种统一稀释后再分装成4份。五、草坪草DNA的RAPD扩增下周免疫共沉淀实验课上统一做（一）实验设备PCR仪（118室）、移液枪、PCR专用管、DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、FR-200A型全自动紫外与可见光分析装置（上海复日科技有限公司）（二）实验试剂2 PCR Mix（天根生化科技有限公司）、DNA Marker：D2000（天根生化科技有限公司）、超纯水（灭菌）、RAPD引物、草坪草基因组DNA。（三）引物的合成合成的RAPD引物共32条，引物的名称和序列（由5-3）如下，规格为5 OD。序号引物名称引物序列（53）100M 储备液（l）1OPA01CAGGCCCTTC5572OPA02TGCCGAGCTG5423OPA04AATCGGGCTG5384OPA05AGGGGTCTTG5325OPA09GGGTAACGCC5406OPA12TCGGCGATAG5387OPA17GACCGCTTGT5478OPA20GTTGCGATCC5479OPB01GTTTCGCTCC55610OPB07GGTGACGCAG53311OPB08GTCCACACGG54812OPB10CTGCTGGGAC54213OPB11GTAGACCCGT54514OPB12CCTTGACGCA55215OPC05GATGACCGCC54816OPC12TGTCATCCCC56117OPC13AAGCCTCGTC55218OPD10GGTCTACACC55219OPD17TTTCCCACGG55420OPD19CTGGGGACTT53921OPD20ACCCGGTCAC55522OPE01CCCAAGGTCC55523OPE07AGATGCAGCC54324OPE08TCACCACGGT55225OPE15ACGCACAACC55626OPH18GGGCTAGTCA53827OPN20GGTGCTCCGT54428OPR13GGACGACAAG53529OPR16CTCTGCGCGT55130OPX02TTCCGCCACC56431OPAH01TCCGCAACCA55832OPAH09AGAACCGAGG535根据引物的分子量大小就可以确定其需要加入超纯水的体积，从而制备贮存液。RAPD引物已配制成贮存液，贮存液浓度为100 M/l。（四）实验步骤1. RAPD引物的稀释将RAPD 引物稀释至10 M/l。即从100 M 储备液中吸取20 l 引物溶液，分别加入180 l的超纯水，并且标号作为反应用引物。2. RAPD-PCR反应混合物的制备（每一大组PCR以16个物种为一组，至少做8种引物，即16*8个，待本周16种DNA提取完毕后，下周免疫共沉淀实验课上统一做）将以下溶液逐一加入灭过菌的规格为200 l 的PCR专用管中，标号。草坪草基因组DNA（20ng-100ng/l） 1 lRAPD 引物（10 M/l） 1 l2 PCR Mix 12.5 l超纯水 10.5 l总体积 25 l3. RAPD-PCR程序94反应3min后开始如下循环：94变性反应1 min 36退火反应1 min72延伸反应2 min 经过以上循环45个以后，最后一个循环72 增加5 min，循环结束后，反应产物置于4 保存，如需长期保存则要放入-20 冰箱中保存。4. 对PCR产物进行TBE凝胶电泳：最后一周统一跑胶制胶：同前，注意胶浓度：1.5%琼脂糖凝胶加样量：第一个泳道槽内加入规格为D2000的DNA Marker 10 l，其他每个泳道槽加入10 l 反应产物+1l loading buffer电泳：设定恒定电压为110 V，电泳时间40min左右。取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。六、结果分析电泳图需要利用软件对其条带进行分析，从而确定各条带的分子质量。其中Quantity One是一款很好的分析TBE凝胶电泳条带的分析软件。主要的操作步骤如下，首先把电泳结果导入软