湖南省长沙市长郡卫星远程学校高中生物《专题二 课题1 微生物的实验室培养 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》课件 新人教版选修1.ppt

微生物的实验室培养 稀释涂布平板法 1 将分别盛有9ml水的6支试管灭菌 并按101 106的顺序编号 2 用移液管吸取1ml培养的菌液 注入第二支试管中 用手指轻压移液管上的橡皮头 吹吸三次 使菌液与水充分混匀 3 从101倍稀释的试管中吸取1ml稀释液 注入102倍稀释的试管中 重复第2步的操作 依次类推 直到完成最后一支试管的稀释 注意 移液管需要经过灭菌 操作时 试管口和移液管离火焰1 2cm处 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行 结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求 想一想 第2步应如何进行无菌操作 问题讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行 结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求 想一想 第2步应如何进行无菌操作 应从操作的各个细节保证 无菌 例如 酒精灯与培养皿的距离要合适 吸管头不要接触任何其他物体 吸管要在酒精灯火焰周围等等 问题讨论 微生物的恒温培养 微生物的恒温培养 微生物的恒温培养 菌种的保存 1 临时保藏 接种到固体斜面培养基 菌落长成后置于4 冰箱保存 2 长期保存 甘油冷冻管藏法 四 课题成果评价 一 培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 2d后无菌落生长 说明培养基的制备是成功的 否则需要重新制备 二 接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色 形状 大小基本一致 并符合大肠杆菌菌落的特点 则说明接种操作是符合要求的 如果培养基上出现了其他菌落 则说明接种过程中 无菌操作还未达到要求 需要分析原因 再次练习 三 是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同 及时观察记录的同学会发现这一点 并能观察到其他一些细微的变化 这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 两个主要目的 1 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 2 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 水生耐热细菌taq thermusaquaticus 耐高温的taqdna聚合酶美国微生物学科布鲁克 t brock 1966年发现耐热细菌 研究思路 一 筛选菌株 尿素分子的立体结构 co nh2 2 h2oco2 2nh3 脲酶 分解尿素的细菌 培养基配方 在微生物学中 将允许特定种类的微生物生长 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 选择培养基 背景知识 测定微生物数量的方法 1 直接计数法 最常用显微镜直接计数法 测定微生物数量的方法 背景知识 1 直接计数法 最常用显微镜直接计数法 先将待测样品制成悬液 然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数 根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数 测定微生物数量的方法 背景知识 优点 设备简单 能观察微生物的形态特征 优点 设备简单 能观察微生物的形态特征 缺点 难以计数微小量多的细菌 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数 2 间接计数法 最常用稀释平板计数法 二 统计菌落数目 二 统计菌落数目 统计菌落数目的理论依据 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液中的一个活菌 因此 恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键 为了保证结果准确 通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上 培养后再选择菌落数在30 300的平板进行计数 每克样品中的菌株数 c v m c 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数v 涂布平板时所用的稀释液的体积 ml m 稀释倍数 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 这是因为当两个或多个细胞连在一起时 平板上观察到的只是一个菌落 因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示 注意 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数 在对应稀释倍数为106的培养基中 得到以下两种统计结果 1 第一位同学在该浓度下涂布了一个平板 统计的菌落数为230 2 第二位同学在该浓度下涂布了三个平板 统计的菌落数分别为21 212和256 该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果 实例1 你认为哪位同学的结果更接近真实值 这两位同学的实验需要改进吗 如果需要 如何改进 第一位同学只涂布了一个平板 没有设置重复组 因此结果不具有说服力 第二位同学考虑到设置重复组的问题 涂布了3个平板 但是 其中1个平板的计数结果与另2个相差太远 说明在操作过程中可能出现了错误 因此 不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值 你认为哪位同学的结果更接近真实值 这两位同学的实验需要改进吗 如果需要 如何改进 因此 这两位同学的实验需要改进 在设计实验时 一定要涂布至少3个平板 作为重复组 才能增强实验的说服力与准确性 在分析实验结果时 一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致 结果不一致 意味着操作有误 需要重新实验 说明设置重复组的重要性 在做本课题的实验时 a同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落 但是 其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落 其他同学认为a同学的结果有问题 他们分析可能是a同学的培养基被杂菌污染了 或者培养基中混入了其他含氮物质 因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长 但是 a同学确信自己的实验操作准确无误 与其他同学的结果之所以不相同 是因为自己所选用的土壤样品不同 但是 a同学确信自己的实验操作准确无误 与其他同学的结果之所以不相同 是因为自己所选用的土壤样品不同 但是 a同学在设计实验的时候并没有设置对照 因而此时也拿不出令同学们信服的证据 你能通过设置对照 帮助a同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗 一是由于土样不同 二是由于培养基污染或操作失误 究竟是哪个原因 可以通过实验来证明 一是由于土样不同 二是由于培养基污染或操作失误 究竟是哪个原因 可以通过实验来证明 一种方案 可以由其他同学用与a同学一样的土样进行实验 如果结果与a同学一致 则证明a无误 如果结果不同 则证明a同学存在操作失误或培养基的配制有问题 另一种方案 将a同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 通过这个事例可以看出 实验结果要有说服力 对照的设置是必不可少的 实验设计 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数 土壤中某样品细菌的分离与计数 从肥沃 湿润的土壤中取样 先铲去表层土3cm左右 再取样 将样品装入事先准备好的信封中 实验步骤 1 土壤取样 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基 实验步骤 2 制备培养基 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基 注 每个稀释度下需要3个选择培养基 1个牛肉膏蛋白胨培养基 稀释倍数为103 107 实验步骤 2 制备培养基 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量 选用的稀释范围相同吗 因为土壤中各类微生物的数量 单位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上层样本中 好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万 放线菌数约为477万 霉菌数约为23 1万 因此 为获得不同类型的微生物 就需要按不同的稀释度进行分离 同时还应当有针对性地提供选择培养的条件 测定土壤中细菌的数量 一般选用104 105和106倍的稀释液进行平板培养 测定放线菌的数量 一般选用103 104和105倍稀释 测定真菌的数量 一般选用102 103和104倍稀释 注 样品的稀释 将10g土样加入盛有90ml无菌生理盐水的锥形瓶中 充分摇匀 吸取上清液1ml 转移至盛有9ml水的无菌试管中 依次等比稀释至107稀释度 并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0 1ml进行平板涂布操作 按照浓度从低到高的顺序涂布平板 不必更换移液管 实验步骤 3 微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在30 下培养 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量 形态等 并做好记录 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中 观察能否变红 不同种类的微生物 往往需要不同的培养温度和培养时间 细菌一般在30 37 的温度下培养1 2d 放线菌一般在25 28 的温度下培养5 7d 而霉菌一般在25 28 的温度下培养3 4d 注 一般来说 在一定的培养条件下 相同的培养基 温度及培养时间 同种微生物表现出稳定的菌落特征 emb培养基与大肠杆菌代谢产物产生紫色带金属光边的菌落 当菌落数目稳定时 选取菌落数在30 300的平板进行计数 在同一稀释度下 至少对3个平板进行重复计数 然后求出平均值 并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目 实验步骤 4 细菌的计数 每克土壤样品菌数 某稀释倍数的菌落平均数 稀释倍数 细菌培养时所用的稀释液体积 一 无菌操作1 取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌 2 应在火焰旁称取土壤 在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中 塞好棉塞 3 在稀释土壤溶液的过程中 每一步都要在火焰旁操作 操作提示 二 做好标记注明培养基种类 培养日期 平板培养样品的稀释度等 三 规划时间 1 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234 那么每克样品中的菌落数是 涂布平板时所用稀释液的体积为0 1ml a 2 34 108b 2 34 109c 234d 23 4 练一练 1 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234 那么每克样品中的菌落数是 涂布平板时所用稀释液的体积为0 1ml a 2 34 108b 2 34 109c 234d 23 4 练一练 2 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目 其结果与实际值相比 a 比实际值高b 比实际值低c 和实际值一致d 比实际值可能高也可能低 2 用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目 其结果与实际值相比 a 比实际值高b 比实际值低c 和实际值一致d 比实际值可能高也可能低 下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是a kh2po4 na2hpo4 mgso4 7h2o 葡萄糖 尿素 琼脂 水b kh2po4 na2hpo4 mgso4 7h2o 葡萄糖 琼脂 水c kh2po4 na2hpo4 mgso4 7h2o 尿素 琼