三维细胞培养技术培训.ppt

主讲人 赛哲生物曾宏彬 水凝胶三维细胞培养 广州赛哲生物科技有限公司服务热线 400 888 4242 什么是三维细胞培养 如何实现三维细胞培养 水凝胶三维细胞培养 更多问题 2 3 4 1 广州赛哲生物科技有限公司服务热线 400 888 4242 什么是三维细胞培养 建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之间的鸿沟 通过模仿体内环境的特性 并利用传统的细胞培养研究工具 三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为 组织器官和肿瘤的发展过程 这些研究模型有利于加速癌症生物学和组织工程领域的转化研究 1 1 什么是三维细胞培养 3D 2D VS 2 如何实现三维细胞培养 水凝胶 固体支架 磁力悬浮 2 如何实现三维细胞培养 固体支架三维培养 组织工程支架作为组织工程的平台 不仅提供了细胞生长的框架 使之形成特定的组织或器官形状 而且作为细胞外基质成分之一 是细胞间信号传导和相互作用的媒介 同时也是细胞生长所必需的生物活性剂 目前用于组织工程支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯 聚偶磷氮 聚酸酐等 其中研究最多的是脂肪族聚酯 特别是聚乳酸 PLA 聚乙醇酸 PGA 及其共聚物等 2 如何实现三维细胞培养 磁力悬浮三维培养 美国莱斯大学和德克萨斯大学M D Anderson癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器 bioassembler 这个系统使用磁力让细胞悬浮 并促使细胞生长成三维的形状 尤其适于培养肝脏和心脏这种细胞密度比较大的实体器官 2 如何实现三维细胞培养 将细胞培植在一定的细胞外基质中 细胞外基质 extracellularmatrix ECM 蛋白充当生长支架 水凝胶三维培养 3 水凝胶三维细胞培养 Matrigel CollagenI Agarose 3 水凝胶三维细胞培养 从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BDMatrigel基底膜基质 其主要成分由层粘连蛋白 型胶原 巢蛋白 硫酸肝素糖蛋白等组成 还包含生长因子和基质金属蛋白酶等 Matrigel 在室温条件下 聚合形成具有生物学活性的三维基质 模拟体内细胞基底膜的结构 组成 物理特性和功能 有利于体外细胞的培养和分化 以及对细胞形态 生化功能 迁移 侵染和基因表达的研究 可促进上皮细胞 肝细胞 Sertoli细胞 黑色素瘤细胞 血管内皮细胞 甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化 同时 Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达 支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化 高浓度的Matrigel适用于研究体内血管生成和肿瘤细胞迁移及肿瘤模型的建立等 3 水凝胶三维细胞培养 I型胶原在大部分组织中都有分布 尤其在骨组织 肌腱以及真皮组织中含量极其丰富 I型胶原一般是分离自大鼠尾中 也常被称为鼠尾胶 Agarose 在酸性条件下成液态 一般保存于醋酸溶液中 使用时 需用PBS稀释成合适的浓度 大于1mg ml 并用氢氧化钠调节PH值至7 2 7 4 可聚合形成具有生物学活性的三维基质 一般用于软骨细胞 骨细胞的三维培养 血管形成试验等 3 水凝胶三维细胞培养 美国布朗大学的生物工程师JeffreyMorgan利用琼脂糖开发出一种细胞三维培养皿 CollagenI 将融化的琼脂糖制成微型培养板 micro moulds 等琼脂糖凝固之后 再将这种琼脂糖材料放置到普通的培养板里 再在培养板里加入细胞和培养基 由于重力的作用 细胞会沉积到琼脂糖培养板里 彼此聚集在一起 形成球形的多细胞团块 3 水凝胶三维细胞培养 试剂盒组分BDMatrigelPBS缓冲液细胞回收液 赛哲生物 水凝胶三维细胞培养系列试剂盒 SZCE13001 SZCE13010 乳腺癌系列 胃癌系列 宫颈癌系列 肝癌系列 肺癌系列分别用于胶上培养 胶内培养 3 水凝胶三维细胞培养 胶内培养 胶上培养 3 水凝胶三维细胞培养 铺胶 胶上培养 薄胶 30 50 L cm2 形成约0 5mm厚度的凝胶胶内培养 薄胶 可选 厚胶 100 200 L cm2 形成大于1mm厚度的厚胶 操作步骤 铺胶前的准备 Matrigel置于冰上融解 使用到的所有器材 吸头 小管 培养板 须冰预冷 铺胶 薄胶 用冰预冷的吸头吸取60 100 L液态的Matrigel 均匀涂抹孔板底部 使其厚度均匀 避免产生气泡 在37 放置30分钟 即可成胶 3 水凝胶三维细胞培养 接种和培养 胶上培养 制备细胞悬液 以合适的密度接种于薄胶上 即可进行培养 胶内培养 制备细胞悬液 调整至合适的细胞密度 取100 200 L与Matrigel等比例混合均匀 接种于孔板中 在37 放置30分钟 成胶后 在胶面上轻轻加入完全培养基即可进行培养 TIPS 一般用于肿瘤微球形成 侵袭等观察 接种密度应控制在2000 3000cells 孔 观察血管形成接种密度需达到105cells 孔 3 水凝胶三维细胞培养 细胞处理 药物刺激 胶上层培养液中加入刺激药物细胞转染 胶上培养 使用sagene3D HG SC1201 三维培养专用转染试剂 使用慢病毒or腺病毒感染胶内培养 使用慢病毒or腺病毒感染 3 水凝胶三维细胞培养 细胞的回收 细胞回收液 cellrecoverysolution 不含酶 能够解聚matrigel1 2ml细胞回收液 轻轻刮起含有细胞的凝胶 禁止吹吸 转入2ml离心管中 置于冰上融解约30min 每隔5 10min来回颠倒一次 待观察到细胞团可顺利沉至管底部 4 3000rpm离心5min 收集细胞 优点 细胞可保持在胶内的形态 不含酶 对细胞伤害小 缺点 凝胶去除不彻底 有可能影响到后续检测 3 水凝胶三维细胞培养 细胞的回收 酶消化 胰酶 0 25 1 2ml酶液 置于37 消化15 30min 待观察到细胞团逐渐散开 3000rpm离心5min 收集细胞 优点 凝胶去除较彻底缺点 对细胞伤害较大 继续培养效果差分散酶 dispase 1 2ml酶液 置于37 消化2hours 待观察到细胞团逐渐散开 3000rpm离心5min 收集细胞 优点 凝胶去除较彻底 对细胞伤害小 可继续培养缺点 耗时长 价格高 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 形态观察 乳腺上皮细胞MCF 10A细胞形成的乳腺腺泡结构 前列腺癌细胞PC3的侵袭性观察 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 实时荧光定量PCR检测mRNA miRNA抽提RNA 不需要除去凝胶 可直接加入trizolorbioopure 抽提RNA 1234 1 不去胶2 不去胶3 去胶4 去胶 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 不去胶去胶 GAPDH Westernblot检测蛋白若检测大分子蛋白 一定要除去凝胶 回收细胞后提取蛋白细胞回收液或酶消化均可 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 细胞增殖检测 MTT法 不需要除去凝胶 可直接加入MTT孵育一定要设不含细胞 只含有凝胶的空白对照孔 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位胶上培养 可直接固定 孵育抗体等操作胶内培养 需回收细胞采用细胞回收液回收细胞 维持细胞团结构 重新接种于圆形盖玻片上 使细胞贴附于玻片上 再进行固定 抗体孵育等步骤 TIPS 抗体孵育或染色后 洗涤次数需增加 时间最好延长至15min若需进行激光共聚焦观察 可直接在厚度为0 13 0 17mm圆形盖玻片上铺胶接种细胞 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位 不去胶 去胶 DAPI tublin overlay 3 水凝胶三维细胞培养 观察与检测 免疫荧光观察蛋白定位 S1cell T4 2cell CAR E Cadherin ConfocalFluorescenceMicroscopy 3 水凝胶三维细胞培养 试剂盒组分SalmonfibringenSalmonthrominPBS缓冲液酶消化液 赛哲乳腺癌肿瘤干细胞筛选试剂盒 专利产品 采用Salmonfibringen在Salmonth