中国药细菌内毒素检查法验证方案

一次性肠外营养输液袋内细菌毒素检查法验证方案编制：日期：审核：日期：批准：日期：1. 验证目的为公司产品细菌内毒素检测方法提供依据。2. 验证依据3. 中华人民共和国药典 2010年版 第二部 附录 E 细菌内毒素检查法4. 验证条件无菌操作间（万级）5. 验证准备4.1 试验设备设备名称设备编号设备状态内毒素检测仪A10-2012-A-004-0完好鼓风式干燥箱A10-2010-A-007-1完好5.2 试剂试剂名称来源批号内毒素工作品（10EU/ml）湛江博康海洋生物1107010鲎试剂(0.25EU/ml)湛江博康海洋生物1206110内毒素检查用水湛江博康海洋生物1204065.3 样品： 样品名称规格型号批号数量一次性肠外营养输液袋PN-E-W 3500ml24.4 实验前准备：1) 实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、耐热器皿须经180烘烤120min。若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对实验无干扰的器械。2) 使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，置30%双氧水中浸泡4小时，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后60烘干备用。或用一次性无热源吸头。5. 样品制备（供试液溶液）将20ml内毒素检查用水注入到一次性肠外营养输液袋内，37孵育60min。作为供试品溶液。6. 鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。因此要求实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。6.1实验操作6.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备：1) 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内；2) 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程请参见标准品使用说明书）。6.1.2 待复核鲎试剂的准备：取规格为0.1mL/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75酒精棉球擦拭后启开备用。每支加入0.1mL检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1mL/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1mL分装到10mm75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。6.1.3 加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），每支分别加入0.1mL 2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准溶液；1列2支（管），每支分别加入0.1mL检查用水。6.1.4 加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入（371）水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(602)min。6.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。6.1.6 实验结果计算如最大浓度2.04管均为阳性，最低浓度0.254管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（c）：c=antilg( X/4 )；式中X为反应终点浓度的对数值（lg）,反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。6.1.7 结果判断当c 在0.52.0(包括0.5和2.0)时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。内毒素浓度（EU/mL）编号0.50.250.1250.0625NC反应终点浓度12347. 内毒素干扰试验7.1 试验溶液配置：编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2入/供试品溶液供试品溶液12482入（0.5EU/ml）1入（0.25EU/ml）0.5入（0.125EU/ml）0.25入（0.0625EU/ml）4444C2入/检查用水检查用水12482入（0.5EU/ml）1入（0.25EU/ml）0.5入（0.125EU/ml）0.25入（0.0625EU/ml）4444D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示的灵敏度的对照系列；D为阴性对照试验将已充分溶解的鲎试剂28支（管）放在试管架上，排成10列，其中A列2支管，每支加入0.1ml的供试品溶液，B为4列B1-B4每列4支（管），每支分别加入0.1mL 2.0、1.0、0.5、0.25的用供试品溶液稀释的内毒素溶液；C为4列C1-C4每列2支（管），每支分别加入0.1mL 2.0、1.0、0.5、0.25的内毒素标准溶液，D列2支（管），每支分别加入0.1mL检查用水。7.2加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入（371）水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温(602)min。7.3观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180观察，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数结果A无/供试品溶液2B2入/供试品溶液12482入1入0.5入0.25入4444C2入/检查用水12482入1入0.5入0.25入4444D无/检查用水27.4结果判断：只有溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核实验要求时，实验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Ea和X1）。Es=antilg( Xs/4 )Et=antilg( Xt/4 ) 式中 Xs和Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）. 当Es在0.52.0（包括0.5和2.0）及在Et在0.5Es2.0Es(包括0.5Es和2.0Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对实验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。7.5实验结论：8. 样品检验8.1 阳性对照溶液的制备用检查用水将标准品稀释制成2.0浓度的内毒素标准溶液。8.2 供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液将内毒素标准品制成2.0浓度的内毒素溶液。8.3 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。8.4 鲎试剂的准备方法同6.1.2。8.5 加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2 支加入0.1mL供试品溶液作为供试品管。2支加入0.1mL阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1mL 检查用水作为阴性对照，2支加入0.1mL供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。8.6 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入（371）水浴或适宜恒温器中，保温(602)min。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。8.7 结果判断 1) 当阳性对照都为阳性，供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方法有效；2) 若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；3) 如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；4) 如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。样品及对照样品管样品阳性阴性对照阳性对照加入量试剂1号2号3号4号5号6号7号8号鲎试剂0.1mL0.1mL0.1mL0.1mL0.1mL0.1ml0.1mL0.1mL供试液0.1mL0.1mL/内毒素阳性对照溶液/0.1mL0.1mL供试液阳性对照溶液/0.1mL0.1mL/细菌内毒素检查用水/0.1mL0.1mL/供试品结果1供试品结果28.8实验结论：9 总体评价及建议验证总体评价：建议：评价人： 日期：验证小组组长： 日期：10方案评审记录方案评审记录评审内容：1、方案设计是否合理本验证方案设计合理