种植年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响[权威资料]

种植年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响 本文档格式为 WORD,感谢你的阅读。 摘要 为探寻栽培年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响，揭示根际土壤微生态与杭白芍品质的关系，收集了 1 4 年杭白芍的根及根际土壤，利用 PCR-DGGE检测土壤菌群多样性；利用 HPLC 检测根中芍药苷含量。结果表明，种植杭白芍能明显降低土壤的酸性，并随着栽培年份增加 pH 酸性持续下降，到第 4 年时土壤 pH、酶活均达到最高，而有机质含量则最低。变性凝胶梯度电泳检测 1 4 年的根际细菌多样性在 3.38 3.61，多样性随栽培年限而上升，说明杭白芍的生长会促进土壤中的细菌多样性。测序结果表明，杭白芍土壤中的优势细菌为 变形菌、 变形菌、放线菌、酸杆菌及厚壁菌等，其中，根际特异菌主要为 变形菌、酸杆菌 Gp1 及放线菌；而在非根际土中 变形菌为特异优势菌群。此外， 1 4 年的杭白芍根际优势细菌组成基本相似，只有少数种类随年份发生改变，表明根际细菌群落的组成主要受杭白芍物种的影响。 HPLC 检测结果表明， 1 4 年杭白芍的芍药苷质量分数分别为 3.26%， 3.30%， 3.36%，3.41%，均超过国家标准，且随生长年份呈上升态势，但无显著性差异。相关性分析可知，芍药苷含量与土壤 pH、细菌多样性呈显著正相关，与有机质呈显著负相关。与其他有连作障碍的作物不同的是，随着栽培年限的延长，杭白芍根际的pH 和细菌多样性不降反升，但优势菌群变化不大，这可能是该植物不产生连作障碍的原因之一。研究表明，农业实践中之所以选择 4 年采收杭白芍根入药的原因之一主要是产量而不是有效成分含量。此外，研究还发现有效成分芍药苷的累积与土壤 pH、有机质和细菌多样性关系密切，证明杭白芍的道地性与土壤微生态环境密切相关。 关键词 杭白芍；根际；变性凝胶梯度电泳；微生物多样性；高效液相色谱；芍药苷 收稿日期 2013-12-13 基金项目 中国博士后科学基金项目（ 2013M531484）；浙江省博士后科研项目（ BSH1301033）；浙江省高校中青年学科带头人学术攀登项目（ pd2013215） 通信作者 袁小凤，博士，副教授，主要研究方向为药用植物学， Tel：（ 0571） 86633051， E-mail：13184220300163.com 白芍为毛茛科芍药属植物芍药 Paeonia lactiflora 的干燥根，在中国有悠久的栽培历史，驰名中外，其根并入药，能养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。临床用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，肋痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。主产浙江、安徽、四川等地。此外，山东、贵州、湖南、湖北、甘肃、陕西、河南、云南等地亦产。浙江产杭白芍的品质最佳，居全国芍药之首，是著名的道地药材 “ 浙八味 ” 之一。杭白芍为多年生草本，其生长周期 4 6年，生产实践中以 4 年收获白芍根最为常见，药典规定白芍饮片含芍药苷（ C）不得少于 1.2%1。目前，在我国耕地 面积降低以及后备耕地资源不足的情况下，为提高耕地利用率，有必要研究 1 4 年的杭白芍其药效成分的累积动态及中药品质，了解生长年限对杭白芍品质的影响，探索采收种植 4年杭白芍的合理性。 研究表明，道地药材是一个与生态环境、遗传密切相关的开放的复杂系统 2。道地药材的道地性与产地的气候、土壤理化条件等环境生态方面关系密切 3。其中，土壤微生物是土壤生态系统的核心，它们直接或间接参与了土壤中几乎所有的物理、化学和生物学反应，对土壤肥力及植物生长代谢非常重要，对道地药材内在成分的质量影响最大 4。目前有 关杭白芍的研究主要集中在药效、栽培和加工等方面，对于白芍的土壤微生物等关注不多，而了解其微生态环境对杭白芍生长的作用，以及杭白芍的生长年限反过来对微生态环境的影响，有助于阐明杭白芍道地性形成的微生态作用机制。因此，作者栽培并收集了 1 4 年杭白芍的根，同时收集其根际土壤，利用 HPLC 检测根中芍药苷含量，利用 PCR-DGGE检测土壤菌群多样性，分析杭白芍根际土壤微生态与杭白芍品质的关系，为探索中药道地性与环境生态的相关性提供理论支持。 1 材料与方法 1.1 实验设计和样品采集 野外栽培实验 设在规范栽培基地磐安，实验分 4 组： 2011 年栽培的杭白芍（一年生）；2010 年栽培的杭白芍（二年生）； 2009 年栽培的杭白芍（三年生）； 2008 年栽培的杭白芍（四年生）。实验地设在同一块地，土壤类型完全相同，每一组 1 m5 m ，相邻而种，整个实验过程设专人管理。 2011 年的 7 月 12 日晴天下午 14：00 左右采样，用五点取样法分别采集一至四年生杭白芍根及其根际土壤 5。采样时，刨去表层土壤，将白芍整个植株挖出，轻轻抖掉根系上的大块土壤，收集仍旧黏附于根部的土壤颗粒，每组大概随机采集 10 株左右，所收集的土壤混 匀，过 20 目筛，以去除动植物残体和石块，此为根际土。将混合的根际土装入 50 mL 无菌离心管，每组 3 管，放入冰盒，速带回实验室，保存于 -20 冰箱中，用于菌群多样性检测。同时采集 50 g 左右的根际土装入无菌袋中，这部分土样将自然风干，用于土壤理化性质检测。非根际土为对照土，是指与根际土相对应的土壤，采自与植物杭白芍根际有一定距离的同一地块中，采集后现场处理方法同根际土。此外，采挖芍药根，除去根茎及须根，洗净，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍根发软，捞出晒干、切片、打粉后待用 1。每个样品 3 个重复。 1.2 土壤 pH、有机质及酶活的检测 采用电极法 6测土壤 pH，低温外热重铬酸钾氧化 -比色法 7测土壤有机质，苯酚 -次氯酸钠比色法 8测土壤脲酶活性，磷酸苯二钠比色法 8测定土壤磷酸酶活性。 1.3 土壤总基因组 DNA 提取及 PCR 扩增 称取 1.0 g 土壤样品进行总基因组 DNA 的提取，具体的提取步骤按照UltraClean dNTPs， 2.5 L 的二甲基亚砜（ DMSO）以及 5 U的 Taq DNA 聚合酶。采用 Touchdown-PCR 策略： 94 预变性4 min，前 20 个循环， 94 变性 45 s， 65 退火 75 s（每个循环下降 0.5 ）， 72 延伸 1 min；后 10 个循环为94 变性 45 s， 55 退火 75 s， 72 延伸 1 min，最后再72 延伸 5 min。 PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，将 PCR 产物进行纯化（ Axygen DNA 分离纯化试剂盒，美国）， -20 冰箱保存。 1.4 DGGE 及测序 利用 DGGE（ BioRad，美国）分离 PCR产物。制备变性梯度胶，使其变性梯度为 30% 60%，电泳缓冲液为 1TAE 。 DGGE 电泳条件为：电压 160 V， 温度60 ，时间 6.5 h。电泳结束后， SYBR-green I 染色 30 min，将染色后的 DGGE 胶用凝胶成像系统 Gel Doc 2000（ BioRad，美国）拍照保存，用于多样性分析。 DGGE 电泳之后，选择相对比较清晰的条带进行割胶回收，用 F357/R518引物进行 PCR 扩增，纯化 PCR 产物。分子克隆选用 pMD18-T载体，宿主为 Escherich coli DH 5 （ Takara，日本）。将质粒送检测序（ Invitrogen，上海），运用 Blastn 程序将所测序列与 GenBank 进行同源比对（ http：/./blast），并在 RDP 数据库中（ http： /）对序列进行种属鉴定。 1.5 芍药苷含量的检测 根据中国药典 2010 年版规定，利用高效液相色谱法检测杭白芍根部芍药苷的含量 1。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈 -0.1%磷酸溶液（ 1486 ）为流动相；检测波长 230 nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于 2 000。取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成 60 mg L 芍药苷溶液，即得对照品溶液。取本品中粉末 0.l g，精密称定，置 50 mL 量瓶中，加稀乙醇，即为供试品溶液。将供试品利用 HPLC 进行芍药苷含量的检测。 1.6 数据分析及处理 利用软件 Quantity One 4.4（ Bio-Rad，美国）分析 DGGE 图谱。根据 DGGE 胶条带的位置和强度计算 Shannon 指数 10。数据采用 SPSS 16.0 统计软件作 Pearson 相关性分析和主成分分析。实验数据用 s（ STDEV）表示，方差分析认为， P四年生（ 3.59） 二年生（ 3.39） 一年生（ 3.38），可以看出，随着杭白芍生长年限的延长，根际土壤的细菌多样性整体呈上升趋势。此外，与非根际土相比，杭白芍根际土的 多样性指数显著高于非根际土，说明杭白芍的生长促使在细菌在根部富集，体现出明显的根际效应。 为进一步了解杭白芍土壤菌群结构，将 DGGE 图谱中比较清晰的条带进行割胶回收（图 1），共回收了 21 条带，进行分子克隆后测序，在 NCBI 和 RDP 数据库中比对，结果见表2。测序结果表明， 21 个克隆全部为未培养菌，条带长度在168 194 bp，主要隶属于 变形菌 Gammaproteobacteria（ 5 条带， 24%）， 变形菌 Alphaproteobacteria（ 3 条带， 14%），放线菌 Actinobacteria（ 4 条带， 19%），酸杆菌 Acidobacteria（ 2 条带， 10%），厚壁菌门 Firmicute（ 2条带， 10%）以及未知菌（ 5 条带， 23%），说明杭白芍的根际土壤中的优势细菌为 变形菌、 变形菌、放线菌、酸杆菌以及厚壁菌。从图 1 可以看出， S6（ uncultured Actinobacterium clone E1B-B3-114，放线菌）， S8（ uncultured Bacterium clone mus-c48，酸杆菌 Gp1）， S9（ uncultured Bacterium clone 106.52， 变形菌）， S10（ uncultured Alphaproteobacterium clone 3OL8， 变形菌）， S11（ uncultured bacterium RNA B1001R002_G23，酸杆菌 Gp1）， S15（ uncultured Bacterium RNA，未知菌）是根际土的特有条带，说明杭白芍根际特有菌主要为 变形菌，酸杆菌 Gp1 和放线菌。 S1， S2， S5， S7 条带在非根际土特有，而且非常亮，经比对发现除 S2 为未知菌外，其余均为 变形菌，说明 变形菌为非根际土中的优势菌群。 2.3 不同生长年限杭白芍的芍药苷累积动态 按照药典 1规定，从实验基地采回杭白芍根后，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮、生晒、切片、打粉后备用。从不同栽培年份的杭白芍的新鲜根可以非常明显看到侧根的生成以及次生生长。随着杭白芍的生长，根系越来越发达，根的次生生长导致木质化比例增加，周皮的颜色加深，主根越来越粗，而侧根也越来越多。与一至三年生的杭白芍相比，四年生的根的生物量显著增加，因此可以说，产量因素是选择四年生杭白芍入药的原因之一。将采来的样本处理好后，利用高效液相色谱法对不同生长年限杭白芍的芍 药苷含量进行了测定，见图 2。随着生长年限的延长，芍药苷的含量逐渐上升，其中一年生的含量最低，质量分数为 3.26%，四年生的芍药苷含量最高，质量分数达 3.41%，但不同年份含量的统计性差异未达到显著水平。由于一至四年生的杭白芍的芍药苷含量均远远超过国家标准，说明生长年限对芍药苷的含量的影响不大，应该不是选择四年生杭白芍入药的主要原因，之所以选择四年生杭白芍入药其主要因素应该是产量而不是芍药苷的含量。综合外观性状质量、产量以及指标成分含量分析，栽培杭白芍以四年生最为适宜。 2.4 土壤性质与芍药苷含量 的相关性分析 为了探索土壤对杭白芍生长的影响，对不同年限杭白芍根际土壤的 pH、有机质、酶活以及土壤细菌多样性、芍药苷含量的相关性进行了分析（ Spearman， 1-tailed），结果见表 3。 pH 与有机质呈极显著负相关，磷酸酶和脲酶活性呈显著正相关，芍药苷含量与土壤 pH、细菌多样性呈显著正相关，与有机质呈显著负相关。以上关系表明，芍药苷的累积与土壤 pH、有机质和细菌多样性密切相关。 3 讨论 pH 对土壤微生物群落有着复杂的作用，它可以通过影响营养吸收及根外细胞酶的分泌，进而影响土壤微生物的 生长，一般来说，弱碱性适合细菌和放线菌的生长，酸性适合真菌的生长 12。土壤 pH 与栽培方式和种植年限密切相关，刘建霞等分析种植年限与黄瓜温室土壤理化性质变化规律的关系发现，土壤 pH 随种植年限的延长显著降低 13。许多研究均发现在持续一定年限后，设施栽培普遍出现土壤酸化和盐渍化等现象 14，在一些不适合连作的作物中表现尤为明显，与本研究结果正好相反。分析认为，这可能跟作物是否适合连作有关。不适合连作的植物多为一年生草本，而杭白芍为多年生半灌木，需连续种植 4 5 年才采收，这种栽培模式不同于连作，杭白芍在生 长过程中与土壤的互作可能与其他易产生连作障碍的作物不同，其根泌物的成分可能会导致pH 上升而不是下降，当然杭白芍根泌物的成分还有待下一步实验证明。同时，随着杭白芍的栽培年限延长，细菌多样性也明显上升，该结果与连作障碍的作物也不同 15-16。事实上，不同作物连作对土壤微生物的影响特性是不同的 17，而作物连作对土壤生态系统中微生物的这种不同影响，可能也是有的作物不能连作，而有的作物能够连作的原因之一18。 酸杆菌广泛存在于自然界，在许多生态系统中发挥重要作用，主要分为 8 个类群 Gp1-8，大多 为嗜酸菌，目前对它们的了解还很少 19。其中， Gp1 类群对土壤 pH 非常敏感，当土壤 pH6.5 时在土壤中几乎检测不到 20。研究发现，杭白芍的根际土壤 pH 均 6.0， Gp1 被证实是杭白芍根际的优势菌群之一。有趣的是，在酸性最强的非根际土中 GP1 却不是优势菌群。推测酸杆菌 Gp1 的生长和聚集除了 pH 以外，必定还与其他因素相关，可能与杭白芍的根泌物有关。目前对它们的研究还很少，值得进一步挖掘。此外，实验还发现杭白芍的另一类根际优势菌主要为 -变形菌，而非根际土中为 -变形菌。 -变形菌除包括光合的种类外，还有代 谢 C1 化合物的种类以及与植物共生的细菌等。 -变形菌包括一些医学上和科学研究中很重要的类群，如肠杆菌科Enterobacteraceae、弧菌科 Vibrionaceae 和假单胞菌科Pseudomonadaceae，很多重要的病原菌属于这个纲 21-22。由此可见，因为杭白芍的存在直接影响和决定了根际的优势菌群。 在植物生长过程中，根系作为植物和土壤的接触部分，在从土壤中吸收水分、养分的同时，通过根分泌的方式向根周围释放出各种化合物，产生根际效应，进而调控或影响植株的生长发育 23。土壤微生物在 植物根际的定殖及分布也会受到根系生长发育、环境条件等因素的影响而表现出较为明显的根际效应，并且根际微生物在调节根际微生态系统的动态平衡、提高药材对环境的适应性等方面起着非常重要的生态效应 24-25。根系分泌物是植物根系与根际微生物相互作用的信息物质和决定因素 26，由于根根际效应往往导致根际及根表面的微生物种群密度和种类要明显高于非根际土 27-29。杭白芍也不例外，其根际土壤 pH、有机质含量、酶活性以及细菌多样性明显高于非根际土，体现出典型的根际效应，这与杭白芍根际向环境中释放有机化合物有关。 HPLC 检测结果表明，一年生的杭白芍其芍药苷质量分数已达 3.26%，符合药典规定，也就是说从药效成分的含量方面来看，一年生的根就可入药，但生产实践中，一般要 4 年以后才采收，究其原因，可能主要跟产量和效益有关。杭白芍为多年生亚灌木，一年生的根部与 4 年的根相比，由于根的次生生长导致地下部粗厚的程度和产量大大增加。此外，相关性分析表明，芍药苷的累积与土壤 pH、有机质和细菌多样性关系密切，研究发现在道地产区磐安杭白芍的芍药苷含量相当高，初步证明杭白芍的道地性与磐安土壤微生态环境密切相关。在下一步的实验中，将 研究杭白芍的根分泌物的组成以及非道地产区与道地产区的杭白芍对比，进一步探索杭白芍道地性形成的微生态作用机制。 参考文献 1 中国药典 .一部 S. 2005： 205. 2 肖小河， 陈士林， 黄璐琦， 等 . 中国道地药材研究 20 年概论 J. 中国中药杂志， 2009， 34（ 5）： 519. 3 李慧， 陈冠雄， 张颖 . 分子生物学方法在污染土壤微生物多样性研究中的应用 J. 土壤学报， 2002， 41（ 4）： 612. 4 江曙， 段金廒 ， 钱大玮， 等 . 根际微生物对药材道地性的影响 J. 土壤， 2009， 41（ 3）： 344. 5 Smalla K， Wieland G， Buchner A， et al. 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In the fourth year， soil pH and enzyme activity reached the highest level， while organic matter content was the lowest. The bacterial diversity had a positive correlation with growing years varied from 3.38 to 3.61. Sequencing results demonstrated that Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Actinobacteria， Acidobacteria and Firmicutes were predominant bacteria kinds in the soil of P. lactiflora. Gammaproteobacteria was only detected in the bulk soil， while Alphaproteobacteria， Acidobacteria_Gp1， Actinobacteria were only in the rhizosphere soil and the bacterial community among different growing years were similar except few species. HLPC results showed that paeoniflorin content was 3.26%， 3.30%， 3.36%， 3.41% separately from one to four-year-old P. lactiflora with an upward trend. The correlation analysis indicated that the paeoniflorin content had a positive correlation with soil pH and bacterial