（预防兽医学专业论文）牛乳铁素基因的克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达.pdf

摘要 牛乳铁素基因的克隆及在 大肠杆菌和毕赤酵母中的表达 预防兽医学专业硕士研究生俞春英 指导教师彭远义教授 摘要 乳铁蛋白f l f ) 是一种具有多种生物学功能的天然活性铁结合糖蛋自，在杀菌、抗病毒、 免疫调节等方面起重要作用是调节动物体液中自由铁离子水平的转铁家族中最重要的成员。 天然乳铁蛋白主要存在于动物乳汁尤其是人初乳中，含量可达6 8 m g m l ，乳铁素是乳铁蛋白 在酸性条件下经蛋白酶消化后从n 端释放出来的个小肽段，并且抗菌活性强于乳铁蛋白。 国外对牛乳铁素、人乳铁素、山羊乳铁索、鼠乳铁素等的抗菌活性进行了比较，结果发现牛 乳铁索的抗菌活性最强。牛乳铁素( l f c i n b ) 作为一种广谱高效的抗菌肚，在替代传统抗生素研 究中显示了巨大的潜力和广阔的应用前景。由于自然界中的l f c m b 资源有限，提取成本高，本 试验拟通过基因工程技术建立一个体外高效表达系统，以期为大量获得l f c i n b 并进行深入研究 奠定基础。 本试验根据g e n b a n k 中己报道的b l f 基因( n o ：n m1 8 0 9 9 8 ) ，化学合成l f c i n b 的单链基 因序列。以合成的序列为模板，用相应的特异性引物扩增l f c i n b 基因。结果表明扩增得到的 p c r 产物浓度高、特异性强，且大小在9 2 b p 左右。将p c r 产物直接克隆到p m d l 8 t 载体上， 经过菌落p c r 鉴定和b a m h 【s a li 限制性内切酶酶切分析，初步确认目的基因已克隆入t 载 体。将含重组质粒的菌液送上海生物工程公司测序，结果与本试验所合成的单链基冈序列同 源性为1 0 0 ，表明扩增得到的是l f c i n b 基因。 p c r 产物经回收纯化后用艮衄i 、n o ti 限制性内切酶进行双酶切，胶同收获得连接用 l f c i n b 基因片段。将原核表达载体p e t - 2 2 b ( + ) 和真核表达载体p p i c 9 k 分别用e c o ri 、n o ti 跟制性内切酶进行双酶切，然后胶回收目的片段。 将酶切的p c r 产物与酶切的原核表达载体p e t - 2 2 b ( + ) 连接并转化大肠杆菌b l 2 1 感受态 细胞，加入i p t g 诱导目的蛋白的表达，分别收集诱导2 h 、3 h 、4 h 的菌液。同时、殴一个不加 i p t g 诱导的空白对照和一个经i p t g 诱导的非重组菌对照。经菌落p c r 鉴定、酶切分析确认 l f c i n b 基因已经插入了多克隆位点。表达产物经s d s - p a g e 分析，结果在约3 2 k d 的位置有 目的条带，而对照组没有出现这条带，表明目的蛋白得到了表达，且诱导3 h 的表达量最高。 将酶切的p c r 产物与酶切的真核表达载体p p i c 9 k 连接；用s a l1 线性化重组质粒，荠通 过原生质体转化法转入毕赤酵母g s l l 5 感受态细胞。用( 3 4 1 8 浓度分别为0 5 、o 7 5 、1 0 、 1 5 n a g m l 的y p d 平板筛选多拷贝h i s + 转化子，再通过多拷贝h i s + 转化子在m m 和m d 板上 的生长情况进一步确定转化子的表型，最后诱导目的基因在毕赤酵母中的分泌表达。收集的 上清经冷冻干燥浓缩后进行s d s p a g e 分析，结果在分子量约为3 2 k d 的位置有目的产物的 硬南大学硕士学位论文 带而对照组没有出现这条带，表明该菌株可以表达目的蛋白，但目的蛋白的条带是经过浓 缩后才被s d s p a g e 检测到，表明表达的目的蛋白的量不是很理想。将上清液按同样方法浓 缩，用本实验室保存的大肠杆菌对浓缩产物做抑菌试验，初步鉴定其抗菌活性，同时设阴性 对照。结果陌性对照孑l 没有抑翦圈，试验孔有抑菌圈，约为2 4 c m ，说明表达产物具有一定的 抗茁活性。 关键词：牛乳铁素基因克隆大肠杆菌毕赤酵母表达 【f a b s t r a c t c l o n i n go f l f c i n bg e n ea n de e x p r e s s i o no f l f c i n bi ne 箩c h e r i c h i ac o l ia n di np i c h i a p 口s t o r i s d i s c i p l i n e ：p r e v e n t i v ev e t e r i n a r y c a n d i d a t e ：y uc h u n y i n g a d v i s o r ：p r o f p e n gy u a n y i a b s t r a c t l a c t o f e r r i ni sa ni r o n b i n d i n gg l y c o p r o t e i n i th a sm a n yb i o l o g i c a lf u n c t i o n s i tp l a y sa l l i m p o r t a n tr o l ei na n t i b i o s i s ，a n t i v i m s ，i m m u n o l o g i c a lr e g u l a t i o ne t c l a e t o f e r r i na st h em o s ti m p o r t a n t m e m b e r o f t r a n s f e r r i n g f a m i l y w h i c h m o d u l a t e s t h e l e v e lo f f r e e d o m f e r r i i o n i na n i m a l s b o d y f l u i d n a t i v el a c t o f e r r i nm a j o re x i s t s i na n i m a lm i l ke s p e c i m l yi nh u m a nc o l o s t r a l ，a n di t sc o n t e n ti n h u m a nc o l o s t r a li s6 - 8 m e d m l l a c t o f e r r i c i ni sas m a l lp e p t i d ed e r i v e df r o mn l o b eo fl a c t o f e r r i n w i t ha c i d p e p s i nd i g e s t i o ni na c i d i t yc o n d i t i o n ，a n di t sa c t i v i t yo fa n t i b a c t e r i a li sm o r ep o w e r f u lt h a n l a e t o f e n - i n t h ed i f f e r e n c e so fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yf r o ml f c i n b ，l f o i n h ，l f c i n c ，l f c i n mw e r e c o m p a r e df r o ma b r o a dr e s e a r c h t h er e s e a r c hf o u n dt h a tt h ea n t i b a c t e r i a la c h v i t yo f l f c i n bi st h e m o s tp o w e r f u l l f c i n ba sah i g h - p e r f o r m a n c ea n db r o a d - s p e c t r u ma n t i b i o t i cp e p t i d e i td i s p l a y sa n e n o r m o u sp o t e n t i a l i t ya n de x t e n s i v ea p p l i c a t i o np e r s p e c t i v ei nt h er e s e a r c ho f s u b s t i t u t i n gt r a d i t i o n a l a n t i b i o t i c s b e c a u s eo fl i m i t e dr e s o u r c e ，s e t t i n gu pa l le f f e c t i v ee x p r e s s i o ns y s t e mi nv i t r ob yg e n e t i c e n g i n e e r i n g ，w h i c hw i l lp r o v i d ea ni m p o r t a n tb a s i ct og a i nc o n s i d e r a b l el f c i n ba n dc a r r yo u tt h e f u r t h e rr e s e a r c h t h i s e x p e r i m e n ta c c o r d i n g t ot h e r e p o r t e ds e q u e n c e o f l f c i n b g e n e i ng e n b a n k 州o ：n m _ i8 0 9 9 8 ) ，s y n t h e s i z e dt h es i n g l es t r a n do fl f c i n bb yc h e m i c a lm e t h o dt o o kt h es i n g l e s t r a n ds e q u e n c ea st e m p l a t ea n du s e dt h es p e c i a lp r i m e rt oa m p l i f yl f c i n bg e n e ，t h ep c rp r o d u c t w a sh i g hd e n s i t ya n ds t r o n gs p e c i f i c i t y , a n dt h el e n g t hw a s9 2 b pa p p r o x i m a t e l y t h ep r o d u c to f p c r w a sd i r e c t l yc l o n e di n t op m d l 8 - tv e c t o r , t h r o u g ht h er e a c t i o no f c o l o n yp c ra n dd i g e s t i o na n a l y s i s w i t hb a m hi s a lie n z y m e ，i tc o u l ds u r ep r e l i m i n a r yt h a tt h ep u r p o s eg e n eh a dc l o n e di n t otv e c t o r s e n d e dt h eb a c t e r i u mc u l t u r ew h i c hi n c l u d e dr e c o m b i n a n tp l a s m i dt os h a n g h a ib i o t e c h n o l o g y c o m p a n yf o rs e q u e n c i n g ，a n di tv e r i f i e dt h a tt h eh o m o l o g yo fl f c i n bg e n ew a s1 0 0 a tn u c l e o t i d e l e v e lb e t w e e np r o d u c to fp c ra n dt h es i n g l es t r a n do fs y n t h e s i z i n gc h e m i c a l l y ，s ot h ep r o d u c t a m p l i f i e dw a s j u s tt h el f e i n bg e n e p c r p r o d u c tw a sp u r i f i e da n dr e c l a i m e d a n dw a sd i g e s t e db ye ria n dn o ti r e s t r i c t i o n e n z y m e ，t h e nr e c l a i m e dl f c i n bg e n ef o rc o n c e n t r a t i o nb yg e lr e t r i e v a l t h ep r o c a r y o ne x p r e s s i o n v e c t o rp e t - 2 2 b ( + ) a n dt h ee u c a r y o ne x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 kw e r ea l s od i g e s t e db ye c o ria n d n o tir e s t r i c t i o ne n z y m e ，a n dt h e ng e lr e c l a i m e d t h ep c rp r o d u c td i g e s t e dw a sc l o n e di n t op e t - 2 2 b ( + ) v e c t o rd i g e s t e da n dt r a n s f o r m e dt o i i l 西南大学硕士学位论文 b l 2 1t h e na f f i x e di p t gt oi n d u c ee x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i da n dc o l l e c t e dp r o d u c to f e x p r e s s i o ni n d u c e df o r2 h ，3 h ，4 h s i m u l t a n e o u s l y ，s e tu pt w on e g a t i v ec o n t r o l s b yp c r a n dd i g e s t i o n a n a l y s i so fr e s t r i c t i o ne n z y m ea f f i r m e dt h a tl f c i n bg e n eh a db e e ni n s e r t e di n t ot h em u l t i p l ec l o n e s i t e st h ee x p r e s s i o np r o d u c tw a sa n a l y z e db ys d s p a g e , a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec l o n e d r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e di nt h ef o r i l lo fi n c l u s i o nb o d i e si ne c o l ic e l lw i t hm o l e c u l a r w e i g h to f3 2 k da p p r o x i m a t e l y ，b u tt h ec o n t r o l sd i d n t m o r e o v e rt h ep r o d u c t i o ni n d u c e df o r3 hw a s m o s t t h ep c r p r o d u c td i g e s t e dw a s c l o n e di n t op p i c 9 kv e c t o r ，a n dl i n e a r i z e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d w i t hs a li ，a n dt h e nt r a n s f o r m e dt og s l l 5b ys p h e r p l a s tm e t h o dw h i c hg a i n e dh i s + t m n s f o r m a n t s b yi n c u b a t i n g u s e dt h ey p dp l a t e s c o n t a i ng 4 1 8a taf i n a lc o n c e n t r a t i o no f0 5 ，0 7 5 ，l o ， 1 5 m g m lf o rs c r e e n i n gf o rm u l t i p l ec o p yh i s + t r a n s f o r m a n t s t h e nu s e dt h em u l t i p l ec o p i e sh i s + t r a n s f o r m a n t st op l a t eo nm ma n dm dp l a t e sf o rs c r e e n i n gf o rm u t - - a n dm u t 8p h e n o t y p e t h e n i n d u c e dt h e g e n e t o e x p r e s s i np i c h i ap a s t o r i st h es u p e r n a t a n tc o l l e c t e dw a sd r i e db y l y o p h i l i z e r ，a n d t h e nt h ec o n c e n t r a t e dp r o d u c tw a sa n a l y z e db ys d s p a g e t h er e s u l to f e l c c t r o p h o r e t i cw a s t h a ti nt h ep o s i t i o no fm o l e c u l a rw e i g h to f3 2 k da p p r o x i m a t e l yh a da 鲥d d l e o fp o s i t i v ep r o d u c t ，b u tt h ec o n t r o l sd i d n th a v ew h i c hs h o w e dt h a tt h ep r o t e i nh a d b e e ne x p r e s s e d b u tt h e e x p r e s s i o np r o d u c tc o u l db ev e r i f i e d b yc o n c e n t r a t i n g ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h e p r o d u c t i o nw a s h ti d e a l t h es u p e r n a n tw a sc o n c e n t r a t e da s t h es a m ew a y ，t h e nd e t e c t e dt h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw i t hec o l ia n ds e tu pc o n t r o l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n t r o lh o l ei np l a t e d i d n th a v ei n h i b i t i o na p e r t u r e ，b u tt h et e n t a t i v eh o l ei np l a t eh a d ，a n dt h ed i a m e t e ro fh o l ew a s a p p r o x i m a t e l y2 a c r e ，w h i c hs h o w e dt h a tt h el f c i n be x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sh a da n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y k e y w o r d s ：l f c i n bg e n ec l o n i n g e s c h e r i c h i ac o i lp i c h i ap a s t o r i s e x p r e s s i o n 独创性声明 学位论文题目：生翌l 煞塞基固的克隆丞在太题盘茁狸望焘醛堡生煎盘 查 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者： 俞香援 签字日期： 砷年乡月坫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：1 3 不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：俞春定 导师签名： 签字日期： 卿年岁月母日 签字日期：0 月才日 孵垆 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 乳铁蛋白和乳铁素的研究背景 乳铁蛋l 刍( l a c t o f e m n , l f ) 最初于1 9 3 9 年由s o r e n s e n 等在动物乳汁中发现，随后，b a s e l o l i n i 等科学家在一些生物体的体液和各种细胞中亦发现乳铁蛋白的存在，并进行了相关的研究【l l 。 1 9 5 3 年p l u s 等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品口1 ，1 9 6 0 年首先由g r o v e s 从牛乳中分离 获得p 】，同年j o h a m s o n 和m o n 仃e u 等从人乳中分离出l f 【4 1 。1 9 8 4 年法国m e t z b o u t i g e 等测定了 乳铁蛋白整个氨基酸序列p 】。1 9 8 9 年新西- 兰_ a n d e r s o n 等通过x 一射线结晶学分析确定了乳铁蛋白 的三维结构【6 l 。 研究者最初认为l f 是一种与铁的转运和存储有关的蛋白质，所以又称乳转铁蛋白。在研 究过程中又发现乳铁蛋白与铁结合形成的复合物呈红色，故又称之为“红蛋白”。 l f 因最先在乳汁中被发现而得名，后来的研究表明，它也广泛存在于动物体的泪液、唾 液、汗液，胰液、气管、鼻腔分泌物、胆汁、精液等内，外分泌液中。只是在乳汁中含最较 高而在其它分泌物中含量甚微。在各种体液或分泌物中以乳汁特别是初乳中乳铁蛋白晕最 高f 5 7m g m l ) ，人的初乳可达到6 8 m g m l ，人的常乳中含量为2 - 4m g m l 。一般情况下，牛 乳汁中乳铁蛋白含量为0 5 1 0 m m l ，但一旦发生乳房炎，l f 含量明显增加，这表明乳铁蛋白 具有一定的抗炎作用口】。山羊、猪的乳汁中为0 0 2 - 0 2 m g m l ，豚鼠、小鼠和马的乳汁中为 0 2 - 2 m g m l ，大鼠、兔、狗乳汁中的含量低于0 0 5 m g m l 。 乳铁蛋白是一种具有多种生物学功能的天然活性铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，分 子量大约为8 0 k d ，由一条肽链折叠而成，并连接l 2 个配糖体。其组成包括甘露糖、半乳 糖、n 乙酞半乳糖胺、唾液酸、岩藻酸等。x 射线研究表明，组成l f 主体的这条肽链包括两 个结构相似的叶片状结构，分别被命名为n 叶片状和c 叶片状，两个叶片结构通过一条短肽 链连接起来，呈现“二枚银杏叶型”结构。每个叶片状中可结合一个f e ”和一个h c 0 3 或c 0 3 。 口】。碳酸盐构成了“增效”阴离子，使这些蛋白质组分与铁的结合更加紧密。许多学者研究发 现乳铁蛋白的许多功能都与乳铁蛋白n 叶密切相关，而且乳铁蛋白肽( 1 a c t o f e r r i c i n ，l f c i n ) 被认 为是乳铁蛋白的抗菌活性中心，也位于乳铁蛋白n 一叶。l f c i n 是乳铁蛋白在消化道内经酸性胃 蛋白酶水解后的小肽，又称为乳铁素。牛乳铁素位于牛乳铁蛋白n 叶中第1 7 4 1 个氦基酸残 基之问，人乳铁素位于人乳铁蛋白n 叶中的第l - 4 5 个氨基酸残基之间。公羊乳铁素位于公羊 乳铁蛋白n 一叶中的第1 4 4 2 个氨基酸残基之间。乳铁素具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌等 活性，它还是乳铁蛋白与淋巴细胞表面受体和细菌表面l p s 结合的部位最初人们认为乳铁 蛋白的抗菌活性在于靠夺取微生物生长必须的铁离子来阻止其生长。但后来的研究发现乳铁 蛋白的铁离子结合部位与杀菌部位完全不同。l f c i n 没有铁离子结合位点，但它们的杀菌活性 却比l f 高。 1 2 乳铁蛋白和乳铁素的研究进展 1 2 1 乳铁蛋白和乳铁素的分子结构 1 2 1 i 乳铁蛋白的分子结构 l 西南大学硕士学位论文 乳铁蚩白( l f ) 是一种分泌性糖蛋白它的一级结构是由大约7 0 0 个氮基酸组成的肽链。 a n d e r s o n 用x 射线分析法测定了结晶下的h l f 二级结构的组成，徐跃用傅氏转换红外线光谱 仪测定了重水溶液和粉剂状态下的脱辅基b l f 的二级结构组成，两个结果显示，l f 的二级结 构主要是由a 螺旋和b 一折叠( 占7 0 以上) 组成，它们沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列而成， 且a 一螺旋的数鼍远远多于b 一折叠州。 在品体结构中p h e l 7 l e u 2 9 间肽链形成a 螺旋结构，s e r 3 3 a r 9 3 9 1 间肽链形成无规则卷 曲结构，并使一个平行b 一折叠结构与n 端相连。p h e l 7 l e u 2 9 间肽段具有较强的抗菌活性，如 果将其a 螺旋结构变成d 折叠，抗菌活性有较大提高，可能是由于p 一折叠结构易于与细菌表面 接触的缘故i l 。 1 2 1 2 乳铁素的分子结构 乳铁索义称乳铁蛋白活性肽( l f c i n ) ，是乳铁蛋白在酸性条件下经蛋白酶消化后从n 一端释 放出来的一个小肽段，并具有抗菌活性。 牛乳铁索( l f c i n b ) 首先是由b e l l a m y 等1 在牛初乳中提取乳铁蛋白后，经胃蛋白酶裂解后 通过色谱技术分离得到，含2 5 个氨基酸。之后在人、小鼠、山羊、猪等动物乳铁蛋白中也发 现l f c i n b 同源类似物，但牛乳铁素( l f c i n b ) 由于抗菌活性最强及人乳铁素( l f c i n h ) 的来源特殊 性而成为研究热点。 l f c i n b 的二级结构是在一级结构的肽键上折叠而成，其分子是碱性的，具有5 个精氨酸 ( a r g ) 和3 个赖氨酸( l y s ) ，另外还存在一定数量的芳香族色氨酸( t r p ) 和苯丙氨酸( p h e ) ，p i 约 为1 1 8 ，具有强碱性，分子量为3 1 2 6 k d 。来自l f c m b 的2 个半胱氨酸形成二硫键，使l f c i n b 分子薯不完全的桶状( 如图l 所示) ，但研究表明- 二硫键并不影响它的抗菌活性【l ”。1 9 9 9 年 s c h i b l i 等通过核磁共振技术对l f e i n b 的活性中心结构研究却发现，l f c i n b 是两性分子结构( 如 图2 所示) ，碱性的a r g 残基和疏水的t r p 残基充分的分离形成两性的分子结构，a r g 残基在 分子的一端，t r p 残基在分子的另一端，g i n 在分子的中间pj 。这种结构与l f c i n b 的抗菌和抗 病毒功能是分不开的。l f c i n b 的高级结构远比完整的乳铁蛋白分子简单的多。l f c i n b 在完整 乳铁蛋白分子中呈一段螺旋和一段b 折叠结构，当从完整蛋白分子中经胃蛋白酶消化解离 卜来以后原先的螺旋结构消失，在溶液中呈反平行的两段b 折叠结构，并且第3 位和第2 0 位的 胱氨酸之间形成二硫键( s s ) ，起稳定分子结构的作用。然而，l f c i n b 在溶液中的这种 分子结构具有很大的可变性，能根据其所处的外部环境形成特定的构型，l f c i n b 的这种分子 动力学性质可能与其所具有的多种生物学功能有关。 2 l f e i nbm k k l 季 妻 r t f k c - - a 。a 依r a f 图ll f c i n b 的一级结构和二硫键形成的环状结构 f i g lt h ec o v a l e n ts t r u c t u r eo f l f c i n ba n da n n u l u so f d i s u l f i d eb o n df o r m e d 第1 章文献综述 图2l f e i n b 4 9 的三维结构 ( 黑色代表的是t r p 3 和t r p 5 残基。银色代表的是a r g l ，a r 口，a r 9 6 残基) f i 9 2t h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f l f c i n b 4 9 ( b l a c kr e p r e s e n tt r p 3a n dt r p 5r e s i d u e a r g e n t e o u sr e p r e s e n ta r g i , a r 9 2a n da r 9 6r e s i d u e ) 1 2 2 乳铁蛋白和乳铁素的生物学功能及作用机理 1 2 2 1 免疫调节功能 l f 对抗体生成、n k 细胞活性、某些细胞因子生成及前列腺素生成等都有调节作用。s u z u k i 等i t 3 1 发现单核细胞、淋巴细胞、肝细胞、血小板、肠上皮细胞、乳腺表皮细胞的表面都有l f 的受体。2 0 0 5 年p r o g e m t 等发现，l f 能够与免疫细胞表面的受体结合。发挥其免疫调节功能， 与此同时还能调节机体细胞因子的水平。l f 能够抑制因l p s 所诱导的t n f - a ( 可溶性c t 肿瘤 坏死因子) 的释放，并同时诱导i l - 6 ( 白细胞介素- 6 ) 的表达，阻止由于败血症所诱发的死亡。 1 9 9 5 年b r o e k 等1 1 4 l 报道l f 可通过调节铁离子摄取量而影响t 细胞增殖，当铁离子处于 低水平时t 细胞增殖受抑制，反之则t 细胞增殖受到刺激。最近的研究结果也得到类似的结 论即游离铁离子能促进淋巴细胞增殖，而当游离铁离子被乳铁蛋白结合时，则会抑制淋巴 细胞增殖1 1 5 1 。 嗜中性粒细胞是含l f 最多的细胞，有人就提出l f 在机体受感染时可以被释放出来，它 可通过同组织损伤产生的具有潜在毒性的铁离子结合，从而在炎症部位对t 细胞功能起到保 护作用。2 0 0 2 年e l a s s 等发现，l f 能够抑制炎症区域血管内皮细胞内i l 一8 ( 白细胞介素8 ) 的 转录和表达，调节白细胞在炎症区域的聚集，有利于抑制毒血症的发生。l f 也能与补体c d l 4 结合，进一步发挥其免疫调节作用【1 6 l 。 z i m e c k i 等i ”i 在研究l f 对免疫系统的调节作用时提出，l f 在初次免疫应答中对效应细胞 的刺激作用主要是与铁离子转运特性和对细胞某些重要功能的催化作用有关。但d u n c a n 和 m ea r t h u r 的研究却得到了相反的结果，即l f 对初次免疫应答产生下调和抑制作用。究竟哪 种结论是正确的至今还未得到证实。 o m a t a 等1 1 8 i 用小鼠类动物做体外模拟试验和用小猪等所做的试验结果都证实，l f 具有免 3 两南大学硕七学位论文 疫调节功能，能促进抗体生成、t 细胞成熟、淋巴细胞增殖、活化自然杀伤细胞、抑制混合淋 巴球的i l 1 、i l 2 以及肿瘤坏死因子的释放，但具体机制尚不清楚。另外有研究指出，母乳 喂养优于非哺乳喂养在于哺乳不仅为后代提供蛋白类营养物质，还可以为后代提供特异性和 非特异性的免疫作用i j 。 1 2 2 2 促进铁的吸收 l f 作为一种铁强化剂，可促进肠道细胞对铁离子的吸收，其吸收的效果远胜ff e s 0 4 和 f e 2 ( s 0 4 ) 3 。1 9 9 8 年k a w a k a m i 报道，给贫血的小猪喂食，后者的摄入量需要达到前者的4 倍 ( 2 0 0 l t g 5 0 p _ g ) 才能产生相同的治疗效果。1 9 9 9 年姜冬梅等【2 0 1 的试验也得出了类似的结果，进一 步证明了l f 中的铁比f e s 0 4 易吸收。因为乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个铁结合区域 能高亲和、可逆地与铁结合，并维持铁元素在一个较广的p h 范围内而完成铁在十二指肠中的 吸收率，所以母乳喂养的新生动物贫血发病率显著降低。使用l f 不仅可以降低有效铁的使用 鼍，而且l f 鳖合铁以后避免了游离铁对肠道的直接刺激作用b “j 。 l f 主要在肠道中运载铁，因此对于哺乳动物从肠道吸收铁起了重要的作用。转铁蛋白也 是体内运输铁的重要蛋白质，但它是在血液中运输铁。1 9 9 5 年m i k o g a m i 等研究发现，l f 与铁 的亲和力是转铁蛋白的2 5 0 3 0 0 倍，能在p h 值仅为2 2 的情况下，不受损伤的运输铁通过胃。 当l f l r j 达肠道后，就和细胞表面的l f 受体( l f r ) 起反应，然后l f r 进入细胞内部并释放出f e ”， 细胞对铁的吸收有负反馈调节机制，当细胞内缺铁时，细胞表面的l f r 增多，增j j t l l f 与其受 体的结合。 因为l f 能提高铁在动物肠道中的吸收率，所以母乳喂养的新生动物贫血病发病率显著降 低。由丁二母猪乳中l f 含量较低，因此仔猪的缺铁性贫血一直是营养研究中的难点。通过日粮 补充外源性l f ，是降低仔猪缺铁性贫血的有效方法。 i 2 2 3 抗菌作用 l f 的高效抗菌活性最为引人注目，主要表现为抑菌和杀菌作用。1 9 7 2 年b u l l e n 等首先提 出l f 具有抑菌作用。1 9 8 2 年a r n o l d 等通过荧光免疫研究发现，l f 可与菌体表面结合，从而 阻断外界营养物质进入菌体。致使菌体死亡“j 。现己确认，l f 属广谱抑菌剂，既可以抑制 革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等；也可以抑制革兰氏阳性菌，如葡萄球菌等。l f 的 抑菌效果受到诸多因素的影响，其中l f 中铁的饱和度起决定作用1 2 9 月j 。当l f 被铁饱和后， 其抑自性就会减弱。e l i z a b e t h a g r i f f i t h s 等p ”通过体外实验证实了缺铁l f ( 牛和人) 和6 6 铁 饱和l f 可以显著减慢ec o l i 0 1 5 7 ：h 7 的生长，而9 8 的铁饱和l f 则效果不明显。与l f 结 合的抗体( 如s l g a ) 也可促进l f 的抑菌作用。l f 的抑菌效果也与p h 值密切相关：在p h 值7 4 时的效果明显优fp h 值6 8 。p h 8 003 2 肺炎克氏杆菌 8 00 4 7 普通变形杆菌 80o 6 3 铜绿假单胞菌 8 00 6 3 枯草杆菌 i 6o 0 8 牛链球菌 1 60 0 8 李斯特单细胞产生菌1 60 0 8 近几年的研究已确认l f c l n 对肠管出血性0 1 5 7 、甲氧基毒霉桑耐性金黄色葡萄球菌( m r - s a ) 以及引起上部消化管疾患的致病菌h p y o n 等都有较强抗菌作用。s u z u k i 等【l ”研究表明， l f 经胃蚩白酶或胰蛋白酶处理后，虽然不能再结合铁，而且该蛋白的抗原性也受到破坏，但 抗菌活性并不受影响。由此可知，从l f 上酶解下来的一些肽段仍具有生物学活性，井有可能 在幼仔胃肠消化道中继续发挥其抗菌作用。t o m i t a 等忡l 研究了牛乳中l f 经蛋白酶水解后的活 性多肽的抑菌活性，发现经猪胰蛋白酶水解后得到的小分子多肽具有广谱的抑菌作用，可以 抑制一些革兰氏阳性菌乘i 革兰氏阴性菌的生长，甚至包括一些l f 作用不明显的菌株，水解多 肽的抑凶活性明显要高- p l f ，并且与l f 不同的是，l f c i n 的抗菌活性不受铁离子的影响。 国内外研究还显示，在人、猪、牛、羊、鼠等动物的乳铁素中，牛乳铁素的抗菌活性最 强，其独特的理化和生物学活性表现在： ( 1 ) l f c i n b 含2 5 个氨基酸残基，其中有许多正电基团和疏水基团，分子量( m w ) 约为3 2 k d ， 实为l f c i n b 的第1 7 - 4 l 位氨基酸残基组成的小肽；其一级结构为f k c r r w q w r m k k l g a p s l t c v r r a f ，在水溶液中的高级结构为两个反向p 折叠( 无螺旋) ，且疏水基团( f l ，c 3 ， w 6 ，w 8 ，p 1 6 ，1 1 8 和c 2 0 ) 多集中于b 一折叠的单一侧，其可能的抗菌机理与此结构特点有密切关 系。( 2 ) 能耐受动物消化道内蛋白酶或多肽酶的降解作用。( 3 ) l f c i n b 的亲水脂性也赋予其乳化 功能，这对营养物质消化吸收有益。( 4 ) l f e i n b 属小分子活性物质，不会引起动物抗原性反应。 ( 5 ) l f c i n b 具有比b l f 更强和更广4 谱的杀菌能力。l f c i n b 能有效抑制革兰氏阴性和阳性细菌，如 大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i ( 革兰氏阴性菌，g ，下同) 、奇异变形杆菌p r o t e u s mi r a b i l i s ( g 1 、肠 炎沙门氏菌s a l m o n e l l ae n t e r i t i d i s ( g 。) ，肺炎克雷伯氏菌k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e ( g ) 、普通变形杆 菌p r o t e u s v u l g a r i s ( g ) 、结肠耶氏菌y e r s i n i ae n t e r o c o l i t i c a ( g - ) 、铜绿假单胞菌p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ( g - ) ，金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ( 革兰氏阴性菌，g + ，下同) 、链球菌 s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ( g + ) 、白喉棒状杆菌c o r y n e b a c t e r i u md i p h t h e r i a e ( g + ) ，还对真菌( 如白色念 珠菌c a n d i d a al b i c a n s ) 、 病毒、弓形虫( t o x o p l a s m ag o n d i i ) q f l l e p 瘤细胞锋有抑制作用，且其作 用远较b l f 强：能有效地保护用弓形虫攻击的小鼠，减少受试鼠的弓形体病( t o x o p l a s m o s i s ) 发 生率和死亡率：可促进抗生素穿越细菌细胞膜，与多种抗生素具协同作用。( 6 ) 对肠道菌的抑 制作用具选择性。动物肠道有益菌如粪链球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ) 、叔歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m 6 第l 章文献综述 b i f i d u ms t r a i n s ) 和乳酸菌( l a c t o b a c i l l i ) 等对l f c i n b 具强抗性。 1 2 2 4 抗病毒作用 有研究表明l f 对病毒的侵染有一定的保护作用。天然的l f 能抑制人h 1 和h c m v ( 巨细 胞病毒) 对m t 4 细胞和成纤维细胞的致病变作用，其抑制浓度( i c 5 0 ) 分别为3 0 1 0 0 p g m l 和 4 0 r t g m l ，牛l f 抑制病毒的活性约为人l f 的2 5 倍。另8 1 、l f 还可抑制疱疹病毒和丙型肝炎病毒、 流感病毒和旋病毒等。最近日本北里研究所和企业合作，通过临床试验证实牛奶中的l f 能使 丙型肝炎病毒减少，可望成为治疗丙肝的一种辅助疗法。 据m a r c h e t d 等报道人和牛的l f 都具有对单纯疱疹病毒i ( h s v 1 ) 感染的保护作用 4 1 1 。s w a r t 等【4 2 1 发现来自人和牛的乳l f 可以完全屏蔽掉人巨细胞病毒( h c m v )