（遗传学专业论文）aflp标记对日本鳗鲡与中华绒螯蟹种群遗传结构的分析.pdf

摘要 遗传变异的大小及群体遗传结构与一个物种的进化潜力和抵御不良环境的 能力密切相关。种群遗传多样性水平、形成机制及时空分布格局的研究，可揭 示物种的进化历史，保护并可持续地利用该物种。 采用a f l p 分子标记技术对东海两个鳗鲡居群( 苗种来源于闽江流域的成 鳗和长江口捕获的玻璃鳗) 共5 6 个个体的遗传多样性水平及居群的遗传结构进 行了研究。6 对选择性扩增引物共检测到3 6 3 个位点，其中闽江流域、长江口 居群多态位点数分别为2 2 8 、2 6 9 ，来自闽江流域成鳗群低于来自长江口的玻璃 鳗居群( 相应的多态位点频率分别为6 2 8 1 、7 4 1 0 ) 。与此相应的n e i s 基 因多样性系数0 2 7 8 1 、0 3 0 7 7 ，s h a n n o n s 信息指数分别为0 4 0 9 2 、0 4 4 9 3 ，多 态信息指数0 2 4 4 4 、0 2 7 9 1 。分析结果表明：与其它鱼类相比，我国东海这两 个鳗鲡居群具有较丰富的遗传变异。两居群的遗传相似度约为0 8 1 4 ，遗传距离 为0 210 3 。根据个体间n e i s 遗传距离矩阵对两居群内个体进行u p g m a 聚类 分析构建遗传聚类图，结果明显分为两支，表明了它们之间显著的群体分化， 这与传统的随机交配理论推测的结果有一定的差距。本实验是应用a f l p 技术 首次对中国东海日本鳗鲡居群遗传结构状况的研究，对其多态性情况进行了初 步分析，并根据得到的生态和遗传的信息对此结果做出解释。 对分别来自于长江n j b 海进行生殖洄游和镇江丹徒进行索饵洄游的两类中 华绒螯蟹群体5 4 个个体进行a f l p 遗传分析。5 对选择性引物共扩增2 7 0 个位 点，其中多态位点数分别为2 3 5 ( 长江近海) 、2 3 1 ( 镇江丹徒) 相应多态位点 频率分别为( 8 7 0 3 、8 5 5 6 ) 两群体遗传结构相差不大。通过有效等位基因 数( 1 5 7 6 5 、1 6 2 1 4 ) 、n e i s 基因多样性( o 3 3 4 1 、0 3 5 2 3 ) 、s h a n n o n s 信息 指数( o 4 9 3 7 、0 5 1 4 8 ) ( 前者为长江近海，后者为镇江丹徒) 表明镇江丹徒群体 比长江外海遗传多样性水平稍高。两中华绒螯蟹群体遗传指数如此接近说明虽 然生长环境不同且两群体有一定的地理距离，但由于其洄游特性使同一水系的 群体间有基因交流的机会使得群体间的遗传分化水平不显著。说明目前自然环 境下生活的长江蟹生存条件受人为捕捞、污染等人为原因所造成的影响已较 小，较好的维持了蟹苗时的遗传结构状况。 本研究利用a f l p 技术首次对中国东海日本鳗鲡、长江水系中华绒螯蟹的种 群遗传结构进行分析，对其目前的种群遗传状况进行评价，有助于人们更清楚 的认识和了解现阶段以上物种的生物资源状况，为管理部门提供采取解决方案 的依据。在推测和掌握物种群体内遗传变异水平、种群间的遗传分化状况研究 提供参考资料。 关键词：生物多样性日本鳗鲡中华绒螯蟹a f l p n a b s t r a c t g e n e t i cv a r i a t i o n ss i z ea n dc o m m u n i t y sg e n e t i cs t r u c t u r ea r ec l o s e l yr e l a t e dw i 也 as p e c i e s e v o l u t i o np o t e n t i a la n dr e s i s t a n c ep o o rs u n o u n d i n g s a b i l i t y t h ep o p u l a t i o n g e n e t i cd i v e r s i t yl e v e l s ，t h ef o r m i n gm e c h a n i s ma n dt h es p a c ea n dt i m ed i s t r i b u t i o n p a t t e r nr e s 翩地m a yr e v e a lt h es p e c i e s e v o l u t i o nh i s t o r y , t oa n a l y z ei t se v o l u t i o n p o t e n t i a la n df u t u r ed e s t i n yp r o v i d e st h ei m p o r t a n tm a t e r i a l ，w i l lp r o t e c ta n du s e st h e h u m a n i t yl i v e l i h o o dg e n e t i cr e s o u r c e ss u s t a i n a b l e ，s a v i n ga p p r o a c h e st h es p e c i e s w h i c hw i l le x t e r m i n a t e ，p r o t e c t i n gt h et h r e a t e n e ds p e c i e s a f l pa n a l y s i sw a sc o n d u c t e do nt h et w op o p u l a t i o n so fa n g u i l l aj a p o n i c af r o m c h i n e s ee a s ts e a ( t h ea d u l te e l sw h o s es e e d sc a m ef r o mm i n j i a n gr i v e ra n dt h eg l a s s e e l sf r o mt h ec h a n g j i a n gr i v e r ) i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n dt h e g e n e t i cs t r u c t u r eo ft h ep o p u l a t i o n s ，5 6i n d i v i d u a l sw e r ea s s e s s e d u s i n g6s e l e c t i v e a m p l i f yp r i m e r s ，3 6 3d i s c e r n i b l ed n af r a g m e n t sl o c iw e r ed i s t i n g u i s h e d o ft h e s e 2 2 8w e r ep o l y m o r p h i cl o c i 似岫i a n gd r a i n a g e ) ，w h i l e2 6 9w e r ep o l y m o r p h i cl o c i ( c h a n g j i a n gd r a i n a g e ) t h ea d u l te e lp o p u l a t i o nw a sl o w e rt h a nt h eg l a s se e l p o p u l a t i o n ( p o l y m o r p h i cf r e q u e n c i e s w e r e6 2 8 1 、7 4 1 0 n e i si n d e xo f p h e n o t y p i cd i v e r s i t yw e r e0 2 7 81 、0 3 0 7 7 ，s h a n n o ni n d e xs h o w e d0 4 0 9 2 、0 4 4 9 3 ， t h eh e t e r o z y g o s i t yw e r e0 2 4 4 4 、0 2 7 9 1 ) t h ec o m b i n e dr e s u l t so ft h e a n a l y s i so f p o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r ea n dc o m m u n i t yi n v e s t i g a t i o ns u g g e s t e d ：c o m p a r e dw i t h o t h e rf i s h e s ，t h et w oe a s ts e ae e lp o p u l a t i o n sh a da b u n d a n tg e n e t i cv a r i a t i o n , w h i c h i n d i c a t e dt h a th i 曲l e v e l so fg e n e t i cv a r i a t i o ne x i s t e di nt h en a t u r a lp o p u l a t i o n so f c h i n e s ea n g u i l l aj a p o n i c a g e n e t i cs i m i l a r i t yo ft h et w op o p u l a t i o n sw a so 81 4 ， g e n e t i c d i s t a n c ew a s0 2 1 0 3 a c c o r d i n gt on e i sg e n e t i cd i s t a n c em a t r i x ，a n dt h e i n d i v i d u a l so ft h et w op o p u l a t i o n su p g m a g e n e t i cc l u s t e r sw e r ec o n s t r u c t e d i t s h o w e dt h a tt h e r ew a sah i g hl e v e lo fg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o nb e t w e e nt h et w o p o p u l a t i o n s ，w h i c hw e r ed i s c r e p a n tw i t hp a n m x i at h e o r y t h i si st h ef i r s tg e n e t i c s t r u c t u r er e s e a r c ho na n g u i u a j a p o n i c ao fc h i n e s ee a s ts e a , a n di te x h i b i tp i i 玎舱r y a n a l y s i so nt h e i rd i v e r s i t y b a s e do nt h ee c o l o g i c a la n dg e n e t i ci n f o r m a t i o na v a i l a b l e r e s u l t s ，s o m ee x p l a i n sw e r eb r o u g h tf o r w a r d t h eb i o c h e m i c a lg e n e t i c si nt w op o p u l a t i o n so fe r i o c h e i rs i n e n s i sc o l l e c t e df r o m c h a n g i i a n gr i v e r so f f s h o r ew e r ea n a l y z e db ya f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t sl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) o n ep o p u l a t i o nw a si nt h es p a w n i n gm i g r a t i o na n df r o mz h e n j i a n g i 1 1 d a n t u ，t h eo t h e rw a si nf e e d i n gm i g r a t i o n 5 4i n d i v i d u a l sw e r ea s s e s s e du s i n g5 s e l e c t i v ea m p l i f yp r i m e r s ，2 7 0d i s c e r n i b l ed n af r a g m e n t sl o c iw e r ep r o d u c e d o f t h e s e2 3 5w e r ep o l y m o r p h i cl o c i ( c h a n g i i a n gr i v e r so f f s h o r e ) ，w h i l e2 6 9w e r c p o l y m o r p h i cl o c i ( z h e n j i a n gd a n t u ) t h er e s u l ts h o w st h a tt h et w op o p u l a t i o n s g e n e t i cv i a b i l i t ya r es i m i l a r t h em e a ne f f e c t i v en u m b e ro fa l l e l e si nl o c i ( 1 5 7 6 5 、 1 6 2 1 4 ) n e i si n d e xo fp h e n o t y p i cd i v e r s i t yw e r e0 3 5 2 3 、0 3 3 4 1 ，s h a n n o ni n d e x 0 514 8 、0 4 9 3 7s u g g e s tt h eg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o ni nz h e n j i a n gi sal i t t e rh i g h e rt h a n t h ec h a n g i n gr i v e r so f f s h o r ep o p u l a t i o n t h en u m e r i c a lr e s u l t sa l es oa p p r o x i m a t et o e a c ho t h e rt h a ti ti sh a r dt oi d e n t i f i c a t i o n a l t h o u g ht h et w op o p u l a t i o n sa r es p r e a da c e r t a i nd i s t a n c e ，t h ec h a r a c t e ro fm i g r a t i o nm a k et h es a m ew a t e rs y s t e m sp o p u l a t i o n h a v eac h a n c eo fg e n ec o m m u n i c a t i o n s ot h ep o l a r i z a t i o n sb e t w e e nt h et w o p o p u l a t i o n sa r en o ts oo b v i o u s l y a l lt h e s er e s u l t ss h o w st h a tu n d e rt h ep r e s e n tn a t u r a l e n v i r o m e n t se r i o c h e i rs i n e m i ss u f f e r i n gf i s h i n go p e r a t i o n , p o l l u t i o na n do t h e r h u m a nf a c t o r s h a v eb e c o m el i t t l ei n f l u e n c et h a ti st os a yt h e ym a i n t a i nt h eo r i g i n a l g e n e t i cs t m e t u r e s ， t h i sr e s e a r c hu s i n gt h ea f l pt e c h n o l o g yt ot h ec h i n e s ee a s tc h i n a s e aa n g u i u a j a p o n i c a , t h ec h a n g i i a n gr i v e rs y s t e me r i o e h e i rs i n e n s i s p o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r e c a r r i e so nt h ea n a l y s i sf o rt h ef i r s tt i m e ，a n da p p r a i s e st h e i rp r e s e n tb i o l o g i c a l r e s o u r c e sc o n d i t i o n s oi ti sh e l p f u lt oc l e a r l yu n d e r s t a n dt h ep r e s e n ts t a g eo ft h e a b o v es p e c i e sl i v i n gi c s o u r c c sc o n d i t i o n ；a n dp r o v i d eb a s i so fs o l u t i o nf o r t h e m a n a g e m e n td e p a r t m e n t e x t r a p o l a t i n ga n dg r a s p i n gt h es p e c i e s i na n db e t w e e n p o p u l a t i o n s g e n e t i cv a r i a t i o np r o v i d er e f e r e n c et ot h er e s e a r c ho fp o p u l a t i o n s d i f f e r e n t i a t i o n k e y w o r d s ： b i o d i v e r s i t y , a n g u i l l aj a p o n i c a , e i r o c h e i rs i n e n s i s ，a f l p 学位论文独创性声明 本人郑重声明： l 、坚持以“求实、创新竹的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实 的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 盔圭 d f 2 - 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许 论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位 论文在解密后适用本规定 作者签名：幺薹 日 期： 【2 ：区三 第一章前言 第一章前言 1 生物多样性的概念和其保护的意义 生物多样性是物种适应多变的生存环境而得以维持生存、发展和进化的基 础。丰富的生物资源是人类赖以生存的基础，然而由于人类活动的加剧，引起 全球环境的迅速恶化，最大限度地保护生物多样性已成为当今国际社会关注的 热点。目前，生物多样性的研究主要从遗传多样性、物种多样性、生态系统多 样性、景观多样性四个水平开展。保护生物多样性的核心是保护种质资源，其 实质是保存群体的基因组合体系，也可以说遗传多样性( 也叫基因多样性) 是 生物多样性的基础，是物种进化的本质，也是人类社会生存和发展的物质基 础。遗传多样性，是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异的 总和( 施立明，1 9 9 0 ) 。一般认为，- 遗传多样性的大小及其群体遗传结构跟一个 物种的进化潜力和抵御不良环境的能力密切相关，从遗传学和进化角度来讲， 一个物种的遗传多样性的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关， 与生物多样性的形成、消失和发展休戚相关。 。 遗传变异是物种进化的重要原料储备，它与生物多样性的形成、消失和发 展有着密切的联系( c a r o ，2 0 0 4 ) 。一个物种的遗传变异愈丰富，对环境变化的 适应性就愈强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境即遗传多样性为物种的 适应能力、生存能力和进化潜力提供了潜在的遗传基础和储备。蕴藏于生物种 内或种间的遗传变异，不仅是遗传多样性的基础，也是物种保持进化潜能的基 本条件。降低生态系统中物种的丰富富度，可导致其适应能力、对环境改变的 适应能力、生存能力降低，进化上的适应性弱，物种退化，极端情况下甚至威 胁物种生存导致物种的灭绝( 季维智等，1 9 9 9 ) 。即群体内的遗传变异反映了物 种的进化潜力。从保护生物学的角度对物种遗传多样性的了解，有助于物种濒 危原因的探讨以及对物种“命运一的预测。关于它的研究研究将会有助于人们 更清楚的认识生物多样性的起源与进化，为动、植物分类及进化研究提供有益 的资料，进而为生物的遗传育种和遗传改良提供依据。这就是制定合理保护对 策的科学依据，动物和植物的遗传多样性在某种意义上也就是宝贵的遗传资 源。因此对其深入了解不但是现代动植物遗传育种的基础，而且也是为了适应 未来人类需求的变化培育相应的品种做准备。总之，最大限度地维持种内遗传 第一章前言 多样性水平，是持续利用种质资源的前提和基础。研究生物的遗传多样性对于 保护、开发及永续利用生物资源都是十分重要的。“一个基因关系到一个国家的 兴衰，一个物种影响一个国家的经济命脉 ( 季维智等，1 9 9 9 ) 绝不是危言耸 听。 1 1 群体遗传学的研究 一个物种的遗传多样性水平高低及其群体的遗传结构是长期进化的结果。 遗传多样性研究通常可从4 个不同的水平进行，即形态学变异、细胞学染色体 多态性、生化水平( 蛋白质多态性) 和分子水平。前3 个水平都是基因表达型 的标记，可利用的多态座位很少，易受环境影响，不能满足物种资源鉴定的需 要。并且，遗传信息储存在染色体、细胞器和基因组的d n a 序列中，故d n a 水平的遗传多样性就显得格外引人注目。但基因的不可视性使人们辨别遗传水 平的多样性比较困难，当分子标记技术的出现和发展对遗传多样性的检测和研 究提供了手段，帮助人们从分子水平了解物种多样性情况。 1 2 分子标记的种类及比较 目前主要有r f l p ( 限制性片段长度多态性) 、r a p d ( 随机片段长度多态 性) 、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 扩增性片段长度多态性、 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 微卫星和i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 简单 序列重复以及最新出现的s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 单核苷酸多态 性技术。 几种分子标记特点的比较 c o m p a r et h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h em o l e c u l a rm a r k e r s 1 3 分子标记信息在海水渔业研究和管理中的应用 1 遗传变异水平的检测对种群遗传结构分析：种群内和种群间的变异水平、 2 第一章前言 等位基因频率的变异去估计有效群体的大小饵e d g e c o c k , 1 9 9 2 ) 以及混合群体的 识别以便于指导渔民捕捞生长旺盛的群体同时避开弱势群体。 2 系统学研究种间关系、少见种或外来种的鉴定和检测，外来种和本地种的 ， 杂交而产生遗传渐渗后果的研究( h i n d a r , 1 9 9 1 ) 、甚至于鱼卵、幼鱼的鉴定、渔 业生物系统的分类与演化。 3 养殖生物特别是鱼类性别决定机制的研究鱼类具有所有脊椎动物的性别 决定机制，存在于雌雄同体到雌雄异体的各种性别类型，还有性逆转现象。所 以鱼类性别机制的研究对于整个脊椎动物性别决定机理的揭示将是很重要的， 而借助于分子标记将有助于性别决定机制的研究。 4 遗传改良包括遗传图谱的建立和分析、选育的鉴定，遗传变异、缺失、等位 基因频率变化、品系区分、染色体操作结果的鉴定以及转基因鱼、增养殖的研 究。 5 过渡捕捞对遗传变异水平压力的研究遗传漂移或瓶颈效应降低了变异的水 平( w a r d , 19 9 3 ) 以对此提出相应对策。 6 保护生物学特别是濒危生物的保护研究、养殖群体对天然群体的影响及其种 质资源资源的保护。 1 4 养殖群体对天然群体的影响 ， ， 不同渔业生产活动对种群的遗传结构产生不同程度的影响：如人工养殖的经 济性水生动物，由于大部分苗种是有有限繁殖群体( 亲本数量很少) 产生的， 所以一旦这些苗种由于某种原因逃逸到自然水体中i 必然会对自然种群产生负 面影响。近交、杂交与遗传渐渗、遗传瓶颈和遗传漂变，使该物种基因库损失 大量的遗传变异。h i n d a r ( 1 9 9 1 ) 、w a p l e s ( 1 9 9 1 ) 也总结为三个方面：直接的遗传 效应( 近交、杂交和渐渗) 、间接的遗传效应( 由于竞争、捕食、病害或其他因 素引起的选择食性的改变或群体大小的减少) 和对养殖群体的遗传改变( 通过 选择、漂变或群体转移) 。 近亲个体间比远亲个体间在遗传组成上更为相似，所以近交会增加群体中纯 合子的频率，降低杂合子频率。特别是群体很小的时候，近交率大大提高，将 减少群体的遗传变异程度，使遗传多样性水平下降，出现劣质、有害基因的纯 3 第一章前言 合化，导致近交衰退。而“杂交一是指不同品系个体之间的交配，即为分属不 同基因库的个体之间的交配。其结果使得基因从一个基因库带到另一基因库中 去，及发生遗传渐渗。在自然情况下，鱼类中的杂交渐渗并不少见，其与人类 活动造成的物种间杂交而导致的物种多样性丧失不同，它是鱼类物种多样性及 遗传多样性的来源之一，这也说明鱼类基因组的可塑性较强。由于外来种和养 殖个体逃逸的干扰，使野生群体遗传多样性发生变异。 2a f l p 特点介绍 a f l p 是由z a b e a u 和v o s ( z a b e a ua n dv o s ，1 9 9 3 ) 发明的一种新的分子标 记技术，其实质是将多态性以扩增片段长度的不同显现出来。采用它能获得高 信息量的d n a 长度多态性( v o se ta l 。1 9 9 5 ) ，可在较短的时间内掌握大量遗传背 景资料。( 1 ) 它结合了r f l p 的稳定性和r a p d 的简便性，仅需少量模板就可进 行分析同时克服r f l p 带型少、信息量小以及r a p d 标记对条件比较敏感的缺 点。( 2 ) 所需d n a 量少，分析可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数 目很多，所以可产生的标记数目是无限的。( 3 ) 对模板浓度的变化不敏感， d n a 浓度在1 0 0 0 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大。( 4 ) 不受基因组 来源和复杂度的影响，没有种属特异性，对微小差异高度敏感，可靠性好、样 品适用性广。( 5 ) 具有高的的多态性检出率，扩增效率高且简单，是用于分类 和遗传多样性研究中高效、可靠的工具。( 郑成木，2 0 0 3 ) 2 1 a f l p 的应用 利用a f l p 标记进行种质资源的多样性分析，可以获得比其它标记更加可 靠、丰富的品种遗传多样性信息。为合理选配杂交亲本，培育高产、优质、新 品种提供理论依据( 陶文静，1 9 9 8 ；张小平，1 9 9 9 ) a f l p 信息量大、灵敏度 高、能够检测亲缘关系非常近的材料之间的差异，因此利用a f l p 分析海洋生 物的遗传多样性水平，对海洋种质资源保护、遗传育种具有理论指导意义。 a f l p 标记具有高度的特异性、快速性和高效性，且实验结果稳定可靠、易于 标准化，因此该技术在基因定位、基因克隆、种质鉴定、遗传图谱构建、遗传 多样性和系统发生等方面的研究中已被广泛应用。 4 第一章前言 5 3 g a a 【- i c z r l ：aa c a 1 7 t c g 二 一5 ，_钇琶勿- r - r , a 5 f - c o ri 接头 池p 臼目re t ：o ri p ，i - m r + 1 5 一a 匠雹勿拿筮黑 臣乏2 勿a a l l c a 巴互乏夏刁1 1 _ o u y r + 置b o ri 和a 佃i 考t 善k j 山p 懈董b ri a n d量i - ei 5 t a 厂 1 1 一i a 西”i 接头 d a p 它_ rb ，i ei n 慨。a a t 二 = 1 一- c 一5 g r l f a 亡= = = = c a a t = 二二 墨e 住聚p 呵缔曩无腰习e 思臣电毒器 z 舢t q f 叫p o l y a ： 曙，a i 正d e e 丑d t 1 1 1 - 爿p h o r 审i = = ri 接头膜序m ki “p 懈嘲u 嘲 y j j j , 刁= o ri 接头麒序n r 置l d i p t 嘲m a f l p 反应过程示意( 王斌，翁曼丽，1 9 9 8 ) t h ef l o wc h a r to f a f l pr e a c t i o np r o c e s s 1 ) 分类鉴定 k u s u m o ( 2 0 0 0 ) 研究了翅藻不同采样时间、地点的遗传差异。利用a f l p 指纹图谱，可对不同分布的个体区分，遗传相似度变化遵循遗传距离与分布距 离呈正比的关系，并且a f l p 图谱随采样时间的不同而呈现季节性差异。孙易 ( 2 0 0 0 ) 利用r a p d 和a f l p 技术对来自1 5 个种及品系的卤虫进行了研究并 聚类分析，对其分类地位进行了探讨。杨锐( 2 0 0 1 ) 研究了浙江不同地理群体 ( 普陀列岛、渔山列岛、南麓列岛) 及福建坛紫菜遗传多样性，认为遗传距离与 地域分布呈正相关；在对野生型和养殖型的分析中，找到了与叶片厚薄性状相 关的特异分子标记。潘洁等( 2 0 0 2 ) 研究了栉孔扇贝中国长岛群体、韩国东西 部群体的遗传多样性，指出中国群体与韩国群体的遗传差异较大，并找到了3 个地理群体的特征性标记。w a n g 等( 2 0 0 4 ) 利用a f l p 技术对6 种对虾进行了 种属鉴定和系统发生分析。 2 ) 亲缘关系鉴定 5 第一章前言 水生生物在形态、栖息环境、生物学特性等方面都表现出丰富的多样性，但 由于工农业的迅猛发展和人们对水产品需求的剧增，水域生态系统处于持续增 长的压力之下，致使水生生物的生存受到严重威胁，因此保护其资源显得极为 重要。a f l p 技术是基于基因组d n a 水平的差异进行检测，不受组织和器官种 类、发育阶段、生境条件等诸多因素的影响，因此可作为种质鉴定和亲缘关系 及种质分类研究的理想标记。孙易等( 2 0 0 0 ) 利用1 2 对引物检测了1 5 个种及品 系的卤虫，共检测到5 9 4 条带，其中4 8 0 个为多态性标记。聚类分析结果表明， 来自西藏的两性生殖卤虫为不同于中国内陆两性生殖卤虫的新种，内陆和沿海 的孤雌生殖卤虫可能为不同的种。m e c h a n d a 等( 2 0 0 4 ) 用a f l p 技术对5 个海胆 样本进行了检测，结果表明其相似率只有5 4 0 3 ，而子代间的相似率为9 9 - 1 0 0 。刘毕谦等( 2 0 0 5 ) 用a f l p 技术对岱衢族大黄鱼种质的a f l p 分析获得的 岱衢族大黄鱼种质a ：f l p 指纹图谱，可以作为鉴定岱衢族大黄鱼的依据。 3 ) 系统进化中的研究 遗传多样性是生物多样性的基础，也是评价和利用生物种质资源的基础。 a f l p 技术因具有数量丰富、遗传稳定、随机分布、多态性强等特点而被广泛 运用于遗传多样性的研究。通过对近缘种属的遗传多样性分析，用遗传相似度 和遗传距离对种群间的亲缘关系进行量化分析，进而可以构建种群的系统发生 关系( b o o m ，1 9 9 8 ) 。l i u 等( 1 9 9 8 ) 研究了a f l p 标记在斑点鳃、长鳍鲴及其 f 1 、f 2 和回交后代中的应用，结果显示a f l p 标记具有丰富的多态位点、稳定 的孟德尔遗传方式和良好的可重复性。种质的贡献及基因追踪等方面：如f e l i p 等( 2 0 0 0 ) 通过a f l p 指纹图谱研究了舌齿鲈( d i c e n tr a r c h u sl a b r ax ) 的孤雌生 殖，准确鉴定了雌核发育的成功率。c o n g i u ( 2 0 0 1 ) 鉴定了纳氏鲟和美洲鲟杂 交种。王志勇( 2 0 0 2 ) 等对福建官井大黄鱼野生种群和2 个养殖群体用5 对选 择性引物进行了a f l p 分析，共检出5 0 3 个不同扩增片断( 5 0 - 4 5 0b p ) ，发现养 殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群，其遗传多样性 水平较低，遗传变异贫乏。k i m 等( 2 0 0 2 ) 用a f l p 分子标记结合表型分类法 对海胆属的动物进行分类，利用6 对引物共得1 0 8 6 条带，其中9 0 具多态性， 用遗传距离系数和邻接分类法来构建系统树，发现海胆属内亲缘关系较近，种 群间的遗传距离为种群内的3 倍，因此建议将海胆属分为两枝。 6 第一章前言 4 ) 遗传图谱的建立 目前已经发表的遗传图谱仅限于a f l p 标记。m o o r e 等( 1 9 9 9 ) 建立了2 4 6 个日本对虾( p e n a e u sj a p o n i c u s ) a f l p 标记，但只有1 2 9 个标记被定位在4 4 个连锁群，估计覆盖整个基因组的5 7 左右，饱和度也很低。“等( 2 0 0 4 ) 又 分别将2 1 7 和2 1 5 个a f l p 标记到了日本对虾此行和雄性连锁图谱中两个图谱 分别有4 3 和3 1 个连锁群。这个图谱的亮点是第一次将性别相关的标记定位到 了雌虾的连锁图谱中，对于研究对虾的性别决定机理具有重要的意义。邱涛 ( 1 9 9 9 ) 等研究了沼虾属的4 个种：罗氏沼虾、海南沼虾、日本沼虾和粗糙沼 虾的s r f a 指纹，并构建了它们之间的谱系关系图。在斑节对虾，w i l s o n 等 ( 2 0 0 2 ) 利用2 3 个a f l p 引物组合得到了1 1 6 个在3 个家系中共有的a f l p 标 记，构建了一个包括2 0 个连锁群，图距为1 4 1 2 c m 的连锁图谱。几种重要的水 产动物几乎都有一a f l p 为标记的遗传连锁图谱。例如鲶鱼( l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ， 1 9 9 9 b ) 、虹鳟( y o u n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 、罗非鱼( k o c h e re ta 1 ，1 9 9 8 ；a g r e s t ie la 1 ， 2 0 0 0 ) 、青鳝( n a r u s ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 、牡蛎( y ue ta 1 ，2 0 0 2 ；l ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 和对 虾( m o o r ee ta 1 ，1 9 9 9 ：w i l s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ：l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 、牙鲆( c o i m b r ae ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。栉孔扇贝( w a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ；l ie ta 1 ，2 0 0 5 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 遗传连锁 图谱的构建。 3 日本鳗鲡特征介绍 3 1 日本鳗鲡的生物学特征 日本鳗鲡( a n g u i l l aj a p o n i c a ) 属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鳗鲡目、鳗鲡 科、鳗鲡属，是太平洋西岸亚洲各国重要的经济型鱼类，也是我国重要的出口 创汇鱼种之一日本鳗鲡为暖温带降河性洄游鱼类，平时栖息于江河湖泊水库 等的土穴石缝里，以田螺、蛭蟹等挠足类和水生昆虫为食。它们昼伏夜出，喜 欢流水、弱光和穴居，溯水能力极强，潜逃能力也很强，生长肥育期5 8 年， 并开始性成熟。在秋末冬初达到性成熟年龄，但性腺未成熟的鳗鲡亲鱼由淡水 水域向河口移动，顺流入大江，再入大海，雌雄鱼在河口汇合入海后性腺发育 成熟，随流进行集群远涉重洋的降河产卵洄游，目的地为它们的出生地，进行 繁殖( 倪勇，伍汉霖，江苏鱼类志) 。亚洲东部的鳗鲡下海后经过二千多公里的 旅行，到达西太平洋菲律宾以东、关岛以南的中马里亚纳群岛附近水下4 0 0 米 7 第一章前言 深的水域中进行繁殖活动( t s u k a m o t o ，1 9 9 2 ) 。产卵期为5 1 2 月长达半年以 上，其中8 月为产卵高峰( 赵荣兴，2 0 0 5 ) 。繁殖后的亲鱼全部死亡，受精卵 浮于海洋上层，孵化成透明柳树叶状的仔鱼，称为柳叶鳗。柳叶鳗在北赤道洋 流和黑潮的共同作用下漂流、发育，循着它们的父母来时的方向前进。到其父 母下海的河口地带时已长至5 0 7 0 毫米。在河口变态成透明圆筒状幼鳗玻 璃鳗，也叫白仔鳗。变态时，仔鱼停止摄食，体长缩短，变态后体长仅4 0 一5 0 毫米，称为线鳗( 接触淡水生活后颜色逐渐变深) 。每年初春，大批线鳗自海中 经河口集群涌入江河，形成一年一度的鳗苗汛( 随纬度的升高时间向后推延) 。 进入江河后，雌雄分开，各自寻找自己的归宿地栖居，通常雄鳗进入淡水后， 定居于下游的附属水体中。雌鳗继续沿江上溯，游至中、上游水域及附属水体 寻找适当水体栖居。待长成后，再重复父母辈的降海生殖洄游。 3 2 养殖及研究现状 由于其人工育苗技术还不太成功，尚未实现全人工养殖，各国养殖鳗鱼的 苗种大都来自天然海捕，关于其生理繁殖机制也是目前研究热点( 张利红等， 2 0 0 0 ；柳凌等，2 0 0 5 ) 。近些年来借助耳石、超声波的手段( j e l l y m a na n d t s u k a m o t o ，2 0 0 2 ；t s u k a m o t oe ta 1 ，2 0 0 3 a ) 对其产卵地进行精确定位。揭示其繁 殖机理，以助于人工繁殖与资源保护。而为了有效的管理保护这一重要渔业资 源，需要研究其不同种群的遗传结构以及遗传多样性，开展鳗鲡自然资源调 查。这也对保护开发种质资源、进行优良品种培育具有重要意义。 4 中华绒螯蟹的特征介绍 4 1 分类地位与分布 中华绒螯蟹( e r i o c h e i rs i n e n s i s ) ，英文名( c h i n e s em i t t e nh a n d e dc r a b ) ，俗 称中华绒螯蟹又称螃蟹、毛蟹、清水大闸蟹。我国蟹类5 0 0 多种，而其是我国 蟹类中产量最多的淡水蟹。其外部形态主要特征是：螯足密生绒毛，额平直， 具4 个锐齿，额宽小于胸甲宽度的一半。背部覆盖着一层坚硬的背甲；螯足上 长满绒毛，头胸甲明显隆起，额平直，额缘具四个锐齿，额的宽度不超过头胸 甲宽度的一半，额角的后方有六个疣突，前侧边缘具四齿，足强大，其腹部 ( 俗称蟹脐) 的形状是区别雌雄性别的主要标志( 雄性狭长呈三角形，雌性呈 圆形) 。背甲一般呈黑绿色，有时也呈褐黄色，是其对生活环境的一种适应性调 8 第一章前言 节，也是一种自我保护；头胸部的腹面为腹甲包围，腹甲通常为灰白色。中华 绒螯蟹的腹部俗称蟹脐，共分7 节，弯向前方贴在头胸部的腹面，头胸甲的背面 隆起；额宽有4 个尖锐的额齿，形成3 个缺刻，居中的一个缺刻较两边的更深； 额后有6 个突起，前侧缘有4 个齿，第四齿小而明显；螯足掌部与指节基部内外表 面都生有绒毛，腕节内末角有一锐刺，长节背缘近末端处也有一刺；4 对步足长 节末端处均有一刺，腕节与前节背面均有刚毛。 中华绒螯蟹在我国分布很广，分布于北温带，即北纬2 3 。2 6 6 6 。3 4 n 间，东自1 2 4 。e 的鸭绿江口，西至1 1 2 。w 的远离海洋1 0 0 0 多公里的湖北沙 市均有分布。( 张列士，1 9 8 9 ；堵南山，2 0 0 2 ) 北自辽宁，南至福建沿海通海河 流、广东的雷州半岛都有分布。 我国的天然蟹苗资源，主产区为辽河、海河、长江、钱塘江、瓯江、闽江 口，其中长江所占比例最大。由于地理气候的差异、环境分布的广泛以及所处 种群的地理生殖隔离，而形成了不同的种群( t k 系) 。由于其食量大、贪食并有 较强的忍饥