流式细胞仪原理.ppt

流式细胞仪工作原理EPICSXL MCLFC500MCL MPL 流式细胞术的原理 流式细胞术 FCM 是一种能对单个细胞 分子和生物颗粒 微生物 进行多参数快速检测的新型分析和分选技术 近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用 FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作 基本原理 流路流动室鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5 105 1 106个 ml光路光源检测信号光电倍增管PMTHV电路放大电路HV及GAIN增益A D转换统计 计算机 流路 单细胞悬液大多数仪器是在50 300 m大小的孔径中 将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程 成为流体动力学聚焦 FLOWCELL 光路 光源检测信号散射光信号FS 前向角散射光SS 侧向角散射光 90度散射光 荧光信号荧光染料光学滤片颜色补偿 电路 光电倍增管 光路 光源与通过的细胞聚焦在同一点上激光空冷488nmblue 633nmred 325nmUV 514nmgreen 空冷 水冷EnterpriseII水冷Innova300系列Innova70系列 检测信号 散射光信号 前向散射光 FS FS Forward AngelLight Scatter在激光束正前方的检测器 为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小 形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如 大小 前向散射光 散射光信号 侧向散射光 SS Side AngelLight Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器 也称为90度散射光检测器SS的强度与细胞或其他颗粒的大小 形状及opticalhomogeneity有关SS用于检测细胞内部结构如 胞浆内颗粒多少 核质比 侧向散射光 90DegreeScatter 0 200 400 600 800 1000 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils SideScatterProjection LightScatterGating Scale 光路 荧光信号 每种荧光染料均有特定的激发波长 并激发后会有发射波长 流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长 利用各种不同波长的光学滤片来收集 检测 这些光学信号 荧光染料的特性 激发波长 EXCITING 发射波长 EMISSION 常用荧光染料的特性 荧光染料激发波长 nm 发射波长 nm 用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE RD1 488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC633670 光路 滤片特性 当以45o角放置滤片时 该滤片可以通过一定波长的光 同时也可以阻断并折射该波长以下的光这种方式的滤片称为二向色性滤片 dichroicfilter Sourcelight Passedlight Certaincolorsabsorbed Absorbancefilter 标准带通滤片bandpass 光源 通过的光谱 630 30nmBP 615 645nmlight Unique4 ColorSingleLaserDesign PC7 Optics Detectors Photomultipliertube PMT 将光学信号转变为电脉冲 数字数据 信号 不同的脉冲信号被转换成数字通道 CHANNEL 的过程 SingleParameterHistogram CountvsMFI 颜色补偿 各荧光染料发射的荧光信号有重迭 因此要进行色补偿以除去重迭部分 光谱重叠需进行色补偿 减法颜色补偿 减法补偿去除叠加信号 在使用双色以上时会产生减得过多的错误BDFACSCalibur补偿试剂 全矩阵颜色补偿 全矩阵在每个PMT上对于每一个荧光计算 叠加荧光素 的比率通过矩阵去除或加上信号EPICSXLCytomicsFC500 CD45 ECD EPICSXL临床科研型流式细胞仪 EPICSXL 合理的光路设计 单激光激发四色荧光标准模式确保在同一个细胞上获得最多的信息 EPICSXL 直线光路设计 光损失少可互换式光学滤片 方便新染料的应用 PC7 WithThankstoDr FrankSchniedersGentherapieGruppe AbteilungMolekulareZellbiologieInstitutf rMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversit tsklinikumHamburg Eppendorf EGFP EYFPand7 AADWithEPICS XLTMandEXPO32TMADC Software HEK293HumanEmbryonalKidneyCells293 FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLP CellViabilitywith7 AAD HEK293 cellswithEYFPTransfection HEK293 cellswithEGFPTransfection MixtureofEGFP andEYFP transfectedHEK293 CellsEGFP EnhancedGreenFluorescentProtein Ex488 Em507nm EYFP EnhancedYellowFluorescentProtein Ex513 Em527nm 7 AAD 7 Aminoactinomycin ViabilityStain Ex546 Em647nm 四色荧光中的补偿 传统补偿与ADC补偿 EPICSXL 采用最先进的通讯传输设计 光纤通讯与数字信号传输 EPICSXL中的PRISM功能 将多张直方图浓缩在一张上 HowardM Shapiro PracticalFlowCytometry 3rded page355 TheXLispresentlyuniqueamongproductionflowcytometerinitsuseofdigitalelectronicsfortransformationbetweenlinearandlogarithmicsignalsandofcomputeralgorithmforfluorescencecompensation Ihavealreadypraisedthisapproachafewtimes pp 19 166 189 whilealsonothingthatitprobablyrepresentedtheonlypracticalwaytoimplementanotherfeaturewhichpresentlydistinguishestheEPICSXLfromit scompetitors i e 4 colorfluorescenceanalysis Bothfeatureswillhavetheothermanufacturerstryingtoplaycatch upforawhile XL因為有全數字化的線性 數轉換及電腦軟體螢光補償而成為現今流式細胞分析儀系統中最獨特的產品 個人也多次表示欽佩 第19 166 189頁 EPICSXL 單一激光產生 的四個螢光分析性能 使其鶴立於其他競爭者之中 這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕 摘自 流式細胞分析儀系統實務第三版 1995 作者HowardM Shapiro PracticalFlowCytometry 3rded page355 专家评述 来自ISAC的报告 产品介绍 XL设计的所有优势 单激光激发四色荧光光纤通讯数字化信号传递可互换式光学滤片 无需调整光路具有620nm的滤片 最适合DNA倍体分析利用软件进行全矩阵优化 ADC 颜色补偿PRISM浓缩柱形图快速调节电压快速调整补偿补偿向导利用生物样本进行颜色补偿WINDOWS界面操作软件 Cytomics FC500 MCL进样MCL自动模式 MCL直接 或手动 模式 单管固定位置进样 可以暂停 旋转以方便随时添加刺激剂等条码识别样本混匀 产品介绍 硬件 产品介绍 硬件 可选MPL 研究用 24孔每孔样本体积0 5 2 5ml96孔最少体积200ul40管 12x75mm 最少体积500ul固定样本体积吸样25ul样本混匀功能 FC500特点 1根激光同时激发5色荧光2根激光可选3种进样方式4种直方图分辨率5色荧光同时检测 全球第一台单激光激发五色荧光的流式细胞仪全球唯一一台获得QualityleadershipAward的流式细胞仪全球唯一一台获得IBO设计大奖的流式细胞仪全数字化流式细胞仪全自动软件操作 全面兼容LIS系统全自动进样系统全面广泛的临床及科研应用 临床应用 淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测造血干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA B27检查血小板功能及