纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定.doc

纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定1. 纤维素CMC酶1.0标题用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围生产分析和质量控制部门适用。3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。4.0试剂4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5二硝基水杨酸4.4无水葡萄糖4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)4.6氢氧化钠(分析纯)4.7重蒸苯酚(分析纯)4.8无水亚硫酸钠(分析纯)4.9叠氮化钠(分析纯)4.10羧甲基纤维素钠5.0仪器5.1水浴锅(恒温)501 5.2电热干燥箱8015.3 722型分光光度机计5.4分析天平感量0.15.5一级玻璃制品5.6电冰箱60试剂的准备61乙酸乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。6.2 DNS试剂:溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。70标准曲线制作：7.1无水葡萄糖80烘干至恒重。7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4冷藏备用。7.3标准葡萄糖曲线制作 取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。8.0 CMC酶活性测定。8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1g还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。8.2分析程序： 取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50水浴30分钟,再吸取DNS2ml摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm下测OD值。9.0计算活力单位 AD51000CMC酶活力=/g(ml) 30A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）D：酶粉（液）稀释倍数2. FPA酶即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素，释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成正比关系。通过在550NM的光吸收值查对标准曲线，可以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。3. 半纤维素酶：1.0标题用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位2.0范围 生产分析和质量控制部门适用3.0原理半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。4.0单位定义一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。5.0试剂5.1无水醋酸钠（分析纯）5.2冰醋酸（分析纯）5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）5.4木糖（分析纯）5.5四水酒石酸钾钠（分析纯）5.6氢氧化钠（分析纯）5.7重蒸苯酚（分析纯）5.8无水亚硫酸钠（分析纯）5.9叠氮化钠（分析纯）5.10木聚糖（分析纯）6.0仪器6.1水浴锅（恒温）5016.2电热干燥箱8016.3 772型分光光度计6.4分析天平感量0.16.5一级玻璃制品6.6电冰箱7.0试剂的制备：7.1乙酸乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml配成0.1MNaNC溶液。溶液B：称取8.2gNaAC，溶解后容至1000ml，制成0.1MNaAC溶液。使用溶液以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。7.2 DNS试剂溶液A：称分析纯NaoH104g，溶于1300ml水中，加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。B：称分析纯酒石酸钾钠910g溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钾钠加入酒石酸钾钠溶液，将A、B溶液混合加入1200ml中，储存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。7.3木聚糖溶液：用木聚糖以PH4.8醋酸缓冲液配成1%溶液。8.0标准曲线制作：8.1木糖80烘干至恒重。8.2标准称取1.000g木糖以溶于1000ml水中，加10ml叠氮化钠防腐，4冷藏备用。8.3标准木糖曲线制作取1mg/ml标准木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2补加水至2.0ml，加入2.0mlDNS试剂,具塞、沸水浴中加热10分钟，冷却后定容至15ml，分光光度计550nm波长下测OD值，3次重复试验的均值用最小二乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程，由光密度值引得木糖量。9.0半纤维素酶活性测定； 15ml刻度试管中加入稀释酶液0.2ml（三支平行样），再各吸取1.8ml1%的木聚糖溶液，摇匀，50水溶60分钟，取出后，再吸取2mlDNS试剂摇匀，具塞，立即沸水浴反应10分钟，冷却后，补加水定容到15ml