小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结.doc

小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-19 18:39:07 来源:未知 【大 中 小】 评论: 条 -摘要： 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。2、用70乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。6、执行14步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。10、将这些培养瓶放在培养箱中37培养过夜。11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。注释：我们已用CF1品系的鼠制备了成纤维细胞。培养基成分：88 DMEM10 FBS1 NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1、移去MEF培养基2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37培养箱中进行培养。注释：MEF培养基成分：89% DMEM (Gibco # 12100-046)10% FBS (Gibco # 16000-044)1% NEAA (Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。小鼠胚胎成纤维细胞的冻存重悬培养基：80% DMEM20% FBS1% NEAA冻存培养基：60 DMEM30 FBS20 DMSO1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。2、加入胰蛋白酶/EDTA37消化大约5min。3、将细胞吹打下来。4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10。9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：提前标注好冻存细胞的以下信息：细胞系名称传代的代数冻存细胞的数目日期Initials注明冻存/解冻形式小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏1、将冻存瓶从液氮中取出。2、放在37水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95的乙醇消毒？hood是什么？）4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。8、放入37培养箱。9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。网友观点是：1、关于如何确底胚胎期12.5d13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（810 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。2、关于提取MEF的比较好的protocol3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的 AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。网友观点：1、我每次取的是1618天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱4、原代培养的最大天敌还是污染网友观点：MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。网友观点：细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:51:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Col