共培养模型.ppt.Convertor.doc

肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养模型的建立技术背景在肿瘤生长早期，实体肿瘤生长到1到2mm后，其继续生长就会依赖新生血管的形成。在此之前，肿瘤细胞本身已经释放了大量的促血管新生因子诱导肿瘤血管新生。这些新生血管是肿瘤和外界进行物质交换的基础，血管新生与恶性肿瘤的发展、侵袭和转移密切相关。因此，研究血管新生的机理研究，特别是早期的肿瘤血管新生，显得非常必要和迫切。 建立肿瘤血管新生模型是研究其形成机制的重要手段。其中，体外共培养模型是模拟体内肿瘤血管新生的有效方法细胞共培养的概念及意义概念：体外细胞共培养（cell co-culture)：是将两种细胞（可以来自同一种组织，也可以来自不同的组织）混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态和功能稳定表达，并维持较长时间。意义：该技术能模拟体内生成的微环境 ,便于更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用以及探讨药物的作用机制和可能作用的靶点 ,填补了单层细胞培养和整体动物实验的鸿沟。细胞共培养技术目前涉及的方面1. 细胞与细胞之间的接触、作用 ,引起胞质膜的直接接触并产生细胞外基质 ECM ,其含有间质胶原、纤连蛋白、蛋白多糖及层粘连蛋白等成分 ,从而模拟了与体内相似的微环境 ,维持细胞的立体构形及促进细胞的功能2.细胞与细胞之间的相互作用 ,观察细胞共培养后其功能、性状和生长行为的变化 ,如某一细胞的分泌物对另外一种细胞基因表达的影响 ,细胞与细胞之间的“对话”等3.研究药物对细胞形态、功能的影响以及相关机制 ,为新药研发提供重要技术支持 我们现在所做的课题与后两项有关。常用细胞共培养方法：直接接触式共培养： 在合适的条件下，将两种细胞按照一定比例在同一培养皿中共同培养。利用两种细胞或组织接触，通过旁分泌、自分泌分泌细胞因子或直接接触等相互作用方式缺点：两种细胞分离较困难，不便于观察和后续检测。直接接触式共培养非直接接触式共培养非直接接触式共培养： 共培养体系中一者对另者的影响是通过旁分泌的细胞因子相互作用，但两者不接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测。包括以下3种方法：（1）用一种细胞的培养上清液（含有不同生长因子）与另外一种细胞共培养。（2）将玻片上（经过1型胶原凝胶预处理）培养的细胞B，以一定的比例放入细胞A的培养皿中与其共培养。（3）Millicell插入式细胞培养皿（Transwell小室） 是一类有通透性的杯状装置 ,杯子底层放一张有通透性的膜 ,一般常用的是聚碳酸酯膜,孔径大小有 0.112.0u m.将 Transwell 小室放入培养板中 ,细胞A种在上室内 ,下层种植的细胞B 其培养液中的成分可以影响到上室内的细胞 ,从而可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响三维细胞培养(three dimensional cell culture,TDCC)： TDCC是将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养 ,使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构 ,构成三维细胞载体复合物,如现在常用的基质胶 (matrigel),是一种从小鼠肿瘤组织中提取的物质。在室温下，它形成类似于体内的细胞外基底膜的胶状结构，把内皮细胞培Matrigel胶内，内皮细胞表现出新生血管的特征。Matrigel胶方法的局限性是并不能很好模仿体内肿瘤和血管内皮的微环境，细胞分离及提取困难，而且细胞因子的弥散受到一定的影响。本实验选择： 用一种细胞的培养上清液（含有不同生长因子）与另外一种细胞共培养。操作步骤：1.肿瘤条件培养基的收集：取肿瘤细胞于DMEM培养液中常规培养（含10%胎牛血清和双抗），当细胞早期融合时，吸取肿瘤细胞上清液储存起来，并为细胞更换新的DMEM培养基。此后，每两天收集肿瘤细胞上清液一次。收集的条件培养基离心（2000rpm,10min)，并滤过（0.22um微孔膜）以除去漂浮的肿瘤细胞。该肿瘤条件培养基储存于-20度。使用前解冻离心。2.取人脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，接种于培养皿或N孔板内，贴壁培养12小时后吸去培养液，加入肿瘤条件培养液，继续培养。可根据实验需要决定换液时间。3.检测相关指标。参考实验一： CL联合苦参碱抑制胃癌细胞共培养内皮细胞增殖与凋亡 肿瘤细胞培养液刺激内皮细胞生长实验方法：取人胃癌细胞株SGC-7901于 DMEM培养液中常规培养，吸取上清液，用DMEM 培养液配成含7.25%,12.5%,25%,50%4 个质量浓度的肿瘤上清培养液。当HUVEC细胞长成单层后, 经胰酶消化制成单细胞悬液, 接种于96 孔培养板,100uL/孔，贴壁12 小时,吸去培养液, 加入上述4 个质量浓度的肿瘤上清培养液 100ul/孔，对照组加等量含 10%血清的DMEM，继续培养48 小时后, 加MTT在酶标仪上测570 处的 值。本实验在同一条件下重复3次,取3 次实验 值的均数进行统计分析。确定肿瘤细胞培养液促进内皮细胞增殖的最佳剂量。结果：与对照组相比, SGC-7901全部浓度组均显著促内皮细胞生长，（P0.05）,见图1建议：取完全肿瘤培养液培养HUVEC讨论：在体内, 肿瘤的血管新生刺激因子主要来源于肿 瘤 细 胞, 其 中 血 管 内 皮 细 胞 生 长 因 子（VEGF),成纤维细胞生长因子(FGF)是主要的正性调节因子。胃癌细胞存在 VEGF及FGF 表达的增多。VEGF是一种分泌型糖蛋白细胞因子, 在体外培养时，VEGF主要存于培养细胞的条件培养液中，本实验证实了人胃癌SGC-790能促进EVC304的生长。参考实验二：多发性骨髓瘤细胞对共培养内皮细胞分化的影响及其机制的初步研究 评价MM细胞对HUVEC血管新生能力的影响方法 采用人MM细胞系RPM18226细胞或原代MM细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）混合共培养和隔离共培养；以同期单独培养的HUVEC为对照，对与MM细胞共培养的HUVEC进行Matrigel基质管状结构形成实验，评价MM细胞对HUVEC血管新生能力的影响；采用ELISA方法检测两种共培养体系培养上清中脑源性神经营养因子BDNF的含量； 结果：与同期单独培养的HUVEC相比，与RPM18226细胞隔离共培养的HUVEC形成的管状结构数量明显增多，但增加幅度（约75）低于混合共培养体系（约113）。原代MM细胞促HUVEC管状结构形成效应在隔离共培养体系和混合共培养体系分别为138与188。HUVEC单独培养上清中BDNF的含量为（12451）ngml，RPM18226细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（38582）ngml和（31672）ngml；原代MM细胞混合共培养上清和隔离共培养上清的BDNF含量分别为（37187）ngml和（27976）ngml 参考实验三：VEGF高表达的胶质瘤细胞 C6对共培养微血管内皮细胞表 达 Flk一1及 Flt一1的影响方法：实验组 1(c6细胞 +内 皮细胞 共培 养 )：C6以 1106的量 接 种于直径 85cm的细胞培养皿中，12 h后 ，内皮细 胞 以 5105的量接种 于 24 cm50 cm 玻 片上 ，玻 片需 经 1型胶 原凝胶预处理。 内皮细胞 经 12 h培养后已贴壁生长良好 ，将其放人生长有 C6细胞的细胞培 养皿中，培 养液小牛血清浓度降至 2 ，继续共 培养 。 实验组 2：(BRL 3A+内皮细胞 共培 养) 对照组 ：(内皮细胞 +内皮细胞共 培养 )细 胞 接种量及培养时间及方法完 全同实验组 1。 结果： 1.免疫细胞化学结果 实验组1内皮细胞Flk-1,Flt-1的染色加深，阳性细胞核强阳性细胞百分率显著大于对照组，而实验组2的Flk-1,Flt-1的染色变浅，阳性细胞核强阳性细胞百分率明显低于对照组，见图1结果 2. RTPCR检测 Fikl、Fit一1 mRNA的表达 ： 以 GAPDH为内参 照，可见实验组 1的Flk一1、F1t一1 mRNA的表达明显多于对照组(P001)，而实验组 2的Flk一1、F1t一1 mRNA的表 达 明显低 于对 照组 (P001)。琼 脂 糖 凝胶 电泳 分析结 果 如 图 2、3所示 ，电泳 图像 灰 度 分 析结果见 图 4 参考实验四：体外共培养研究乳腺癌细胞株 MCF-7对正常内皮细胞的作用 方法：内皮细胞与乳腺癌细胞株 MCF-7共培养体系中，内皮细胞与乳腺癌细胞株 MCF-7的初始细胞浓度比为2：1。经本研究实验筛选，内皮细胞与乳腺癌细胞株 MCF-7的细胞培养液采用 Z-MCF-7-EC(其中含有FBS、Hepes、谷氨酰胺)，细胞培养时间为1周。共培养后的内皮细胞采用步骤2中免疫磁珠技术分选。透射电镜细胞超微结构、光镜细胞形态学观察，并以看家基因B2m为内参照进行 ESM、IGFBP3、ave3、 VE-C、及Tie-2-2基因半定量 RT-PCR表达分析，以缩时录像技术进行血管新生观察结果：1.形态：经共培养的内皮细胞在光镜下观察，发现共培养后的内皮细胞形态 与正常内皮细胞比较不规则呈现游走状；在透射电镜下观察具有瘤性特征：(1）细胞核膨大 、核胞比侧增大、核仁增 大；(2)细胞质内质网疏松 、变形 ；(3)细胞表而纤毛减少；(4)细胞表面窗孔加深，（5）细胞间隙增大。（图5）2.内皮细胞的管 形成：经乳腺痛细胞株 MCF-7作用后的内皮细胞，有明显管型形成(图6)，而同期对照培养的正常内皮细胞无此现象。3.相关基因表达检测结果：住经乳腺癌细胞共培养条件下的正常内皮细胞与未经共培养的内皮细胞间有相关基因的差异表达(图7表 1) 小结通过共培养体