植物染色体标本的制备和观察.doc

广东第二师范学院生物系实 验 论 文年 级： 专 业： 班级名称： 姓 名： 学 号： 2012-2013-2植物染色体标本的制备和观察摘要：目的 1、掌握常规压片法制备植物染色体标本的基本原理和方法；2、学会观察和统计植物细胞的染色体数目；3、了解和学习去壁低渗法进行植物染色体制片的基本原理和方法。方法 大蒜的根尖是分裂比较旺盛的，我们可以利用秋水仙素处理根尖使得大蒜根尖的细胞分裂处于分裂中期，然后经固定、解离、染色和压片等方法处理染色体染色，即可观察到较多的、处于有丝分裂中期的细胞和染色体。结果 我们可以看到处于分裂期的细胞比较的少，大都是分裂间期的细胞，且染色体被染成红色，同时根据前期：核膜、核仁消失，细胞的体积变大。中期：染色体的形态固定，数目清晰，着丝点排列在赤道板上。后期：着丝点分裂，染色体数目加倍，并平均移向两极。末期：纺锤体消失，染色体变染色质核膜、核仁重新出现的染色体各时期的特点，可以清楚的找到间期和分裂期的细胞。在前期的细胞中，由于经过试验的处理，染色体比较均匀的分布在细胞质内，我们可以清楚地数出染色体的数目，大概是16条。结论 染色体的数目为16条。关键词：大蒜；染色体；改良苯酚品红染液；前言植物的细胞都是由原先的细胞分裂而来，而这一过程伴随着染色体的复制和分离。本实验便是观察染色体的形态和数目。由于细胞的分工，所以我们采用的是分裂比较旺盛的大蒜根尖细胞进行观察。采用常规压片法，其程序包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片等步骤，制得临时装片来观察染色体。1 材料与方法1.1实验材料和试剂材料：大蒜根尖。试剂：0.02%秋水仙素；改良苯酚品红染液；卡诺氏固定液，1N盐酸；70%酒精；95乙醇；85乙醇；蒸馏水。1.2实验方法和步骤1.2.1 取材 先将大蒜浸泡若干小时，然后转入一垫有湿润滤纸的培养皿中，置25恒温培养箱中萌发，待幼根长至12cm时，于上午911时剪下根尖。1.2.2 预处理 将剪下的根尖放进装有0.02%秋水仙素溶液的烧杯中，浸泡处理34小时。1.2.3 固定 将经过预处理或没有预处理的材料，放到卡诺氏固定液中固定 （固定液的量约为材料的10倍，要求一个容器中所装的材料不能太多，温度不能太高）。固定224h后分别在95 和85乙醇中各30min ，再转入70%酒精中，于4冰箱内保存，保存时间最好不超过二个月。1.2.4 去壁解离 取固定好的各种植物根尖，倒去固定液，用蒸馏水漂洗23次，放入1N HCl溶液中60水解812min，再用蒸馏水洗净。适度的水解分离使材料呈白色微透明，状似豆腐，以解剖针能轻轻压碎为好。1.2.5 后低渗 用吸管小心吸去解离液，用蒸馏水慢慢冲洗35次，最后停留在蒸馏水中浸泡2030min左右。1.2.6 染色 将根尖放在载玻片中央，用刀片将根冠和伸长区切除，只留乳白色的分生区，用镊子或解剖针将材料轻轻捣碎。滴上一滴改良苯酚品红染液，染色815min后，盖上盖玻片。1.2.7 压片 在盖玻片上面铺上吸水纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，然后用铅笔的橡皮头轻轻均匀地同一个方向敲打盖片，至肉眼见材料呈雾状即可。敲打时，铅笔应垂直于玻片，勿使盖片移动。1.2.8 镜检观察 先在低倍镜下观察染色和细胞分散的情况，后用油镜（滴加香柏油）找到染色体轮廓清晰、染色适中、分散而不重叠的分裂中期。仔细观察染色形态和计数，对典型分裂相细胞进行显微摄影。对照组：不经过秋水仙素进行预处理这一步，其他的步骤相同。观察大蒜根尖细胞的染色体。2 结果经过秋水仙素处理得细胞，从图所示1中我们可是看到，该细胞基本上是处于分裂前期。染色体比较散乱的分布在整个细胞，且存在姐妹染色体，染色体都比较的粗壮，染色较深。没有经过秋水仙素预处理的细胞，从图示2中我们可以看到，该细胞基本是处于分裂后期，姐妹染色单体分开，向两级运动。染色体比较的细长，颜色较之浅淡。 图示1图示23 讨论大蒜根尖细胞的染色体数目为16条，数目比较的少，有利于同学们的观察和计数。同时大蒜根尖细胞的分裂在上午9-11点和下午3-5点比较旺盛，这个时间段就可以安排同学们实验，直接取材，不用提前固定材料1.。之所以采用秋水仙素预处理，是因为秋水仙素对有丝分裂细胞的纺锤体微管蛋白的聚合有很强的抑制作用，而使雨丝分裂细胞停留于中期，最终导致染色体加倍或染色体非整倍体变异。秋水仙素子细胞学实验中作为染色体预处理剂，以积累较多的中期细胞，并使染色体高度浓缩变短以利分散。卡诺固定液由1份冰醋酸和3份甲醇或乙醇混合而成。这种固定液适用于所有的动植物和人类染色体的固定。固定的时间为15分钟到24小时，温度为室温或稍冷。必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等。随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展；但是如果控制不当则会导致细胞破碎，反而不利于分析。其目的是迅速穿透细胞，杀死细胞，使正在分裂的细胞立即阻留在各自的时相上2。实验中我们需要对细胞去壁解离，其目的在于显著提高染色体的分散程度和平整性。正如我们所知，植物细胞有很坚硬的细胞壁，无法直接采用低渗的方法促使染色体更好地分散，所以需要去壁解离。用空气干燥技术进行植物染色体制片，得到了分散的图像。Kurata和Omra将水稻根尖分生组织进行酶解，用火焰干燥法制备染色体标本也取得了较好效果。陈瑞阳等（1979,1980）用去壁、低渗法对37科105中植物进行了广泛研究，效果良好。Murata以芹菜悬浮培养的细胞和甘蓝的愈伤组织，酶解去壁，低渗处理后制片，也获得了满意的结果。这些都证明了植物染色体制片中的去壁低渗技术可以显著提供染色体的分散程度和平整性3。低渗的目的在于1、使细胞吸收膨胀，增大其体积，以便染色体的观察。同时加大细胞内物质的流动速度，使得染色体能够均匀的分布在细胞内，有利于细胞的观察和计数；2、是使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚每一个扭曲的染色体，因为1965徐道觉发现未做低渗处理时，伴随染色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白的颗粒，显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消失了，可见覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散2。所以说这步是实验的关键步骤。大多数碱性染料均可使细胞核和染色体着色，所以有多种染料可供选用，如甲苯胺蓝、结晶紫、龙胆紫、洋红、碱性品红、番红、美蓝等。经过筛选和比较后，我们发现制临时装片时采用甲苯胺蓝、结晶紫、龙胆紫、醋酸洋红、改良苯酚品红试剂等染色染色效果较好，细胞核和染色体着色较深，细胞质无色或颜色较浅，图像对比差异明显。但从玻片标本保存时间长短来看，还是采用醋酸洋红、改良苯酚品红染色液效果好, 只是染液配制过程较繁琐，配制完成后