（植物学专业论文）基于its序列的东亚七筋姑多倍体复合体研究.pdf

基于it s 序列的东亚七筋姑多倍体 复合体研究 摘要 东亚七筋姑cu d e n s i st r a u t v e tm e y 属百合科黄精族七筋姑属 c l i n t o n i a r a f 多年生草本植物 具有二倍体 2 n 1 4 和四倍体 4 n 2 8 两种细胞型 其中二倍体的分布从中国西南的云南一直延伸到俄罗斯的滨海边区 四倍体除分 布在中国云南及其以西的喜马拉雅地区 日本和萨哈林岛以外 在陕西南部化龙 山北坡海拔2 2 0 0 米以下的阔叶林或针阔混交林下和湖北木林子较狭的范围内也 有分布 在东亚七筋姑种内叶 果实 花序和花粉等形态特征变异复杂多样 但 反映不出倍性上的差异 显示出该种目前正处于强烈的分化阶段 本研究采用克 隆测序的方法检测了1 3 个东亚七筋姑二倍体居群和5 个四倍体居群 共1 8 个居 群的r d n ai t s 序列 研究表明东亚七筋姑i t s 序列长度显示出较高的多态性 i t s l 序列的长度在1 7 l 2 7 0 b p 之间 i t s 2 序列的长度在2 0 5 2 3 8 b p 之间 5 8 s 序列的长度在1 6 2 1 6 4 b p 之间 序列中g c 的含量为4 5 8 3 一5 4 1 3 当空位 g a p 作缺失处理时 东亚七筋姑i t s 区全序列排序后的长度为6 8 2 个 其中简 约性位点2 8 9 个 用m e g a 4 0 计算k i m u r a 双参数法遗传距离 得到1 8 个居群 之间遗传距离平均值为0 2 4 9 结果显示i t s 序列在东亚七筋姑种内有着很大的 变异和分歧 用s p s s 进行双变量相关性分析显示 居群间遗传距离和地理距离 有着较强的正相关性 产o 3 7 2 p 0 0 1 采取最大简约法 m a x i m u mp a r s i m o n ym e t h o d m p 邻接法 n e i g h b o r j o i n i n g m e t h o d n j 和最小进化法 m i n i m u me v o l u t i o n m e 对获得的序列进行分析 并构建分子系统树 探讨东亚七筋姑各居群间的关系和多倍体的起源方式 利用 p a u p 4 0 b 4 a 软件 采取最大简约法分析 获得严格一致树 其步长1 0 5 6 一致 性指数 c i 为o 6 3 0 保留系数 r i 为0 6 8 4 结果表明四倍体居群没有聚为单独 的一支 而是和相邻地理单元的二倍体居群聚为一支 支持东亚七筋姑异地多起 源的推断 关键词 东亚七筋姑 多倍体 i t s 克隆测序 m o l e c u l a rp h y l o g e n yo fc l n i o t n i au d e n s i si n f e r r e df r o m n r d n ai t s s e q u e n c e a b s t r a c t c l n i o t n i au d e n s i st r a u t v e tm e y ap e r e n n i a lh e r b b e l o n g st o t h eg e n u s c l i n t o n i ar a fi nt h et r i b ep o l y g o n a t e a e l i l i a c e a e t w op l o i dl e v e l se x i s ti nt h i s s p e c i e s 2 n 1 4a n d2 n 4 8 t h ed i p l o i dc u d e n s 西i sd i s t r i b u t e df r o mn o r t h w e s t c h i n a sy u n n a np r o v i n c et or u s s i a sp r i m o r s k i yk r a y w h i l et h et e t r a p l o i d sa r e d i s t r i b u t e di ny u n n a n h i m a l a y a s j a p a n m u l i n z ii nh u b e ia n dan a r r o wa r e ai nt h e n o r t h e r nh i l l s i d eo fm t h u a l o n g s h a nb e l o w2 2 0 0a l t i t u d ei ns h a a n x ip r o v i n c e t h e c h a r a c t e r so ft h es h a p ei nl e a f f r u i t i n f l o r e s c e n c ea n dp o l l e ne t a ld i f f e r e n t i a t eg r e a t l y i nt h ei n n e rs p e c i e s b u tn od i f f e r e n c e sa r es h o w e di np l o i dl e v e l t h er e s u l t si n f e rt h e s p e c i e si si nt h es t a g eo fg r e a td i f f e r e n t i a t i o n i t ss e q u e n c e so f 13c l i n t o n i au n d e n s i s d i p l o i dp o p u l a t i o n sa n d5t c t r a p l o i dp o p u l a t i o n sa r er e p o r t e db y c l o n e ds e q u e n c i n g s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w st h a tt h el e n g t ho fi t s lv a r i e sf r o m1 7 1 b pt o2 7 0b p t h e l e n g t ho fi t s 2i sf r o m2 0 5 b pt o2 3 8b pa n d5 8 si sf r o m1 6 2 b p t o1 6 4 b p a m o n gt h e 18i t ss e q u e n c e s2 8 9s i t e sa r ei n f o r m a t i v e t h ec o n t e n t so fg co ft h es e q u e n c e sa r e b e t w e e n4 5 8 3 5 4 1 3 g e n e t i cd i s t a n c e sa r eg a i n e db ym e g a 4 0 t h ea v e r a g e g e n e t i cd i s t a n c eo f18p o p u l a t i o n si s0 2 4 9 t h er e s u l t si n d i c a t et h a ti t ss e q u e n c e s a m o n gt h e 18p o p u l a t i o n sd i f f e r e n t i a t es i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t i v ea n a l y s i sb ys p s s r e v e a l st h a tg e n e t i cd i s t a n c e sa n dg e o g r a p h i c a ld i s t a n c e si nt h e s ep o p u l a t i o n ss h o w p o s i t i v ec o r r e l a t i o n r 0 3 7 2 p 0 0 1 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do nt h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r s i t s o f18 2 6 s r d n ah a v eb e e n c o n d u c t e d u s i n g m a x i m u m p a r s i m o n ym e t h o d m p n e i g h b o r j o i n i n gm e t h o d n j a n dm i n i m u me v o l u t i o n m e p h y l o g e n e t i ct r e e s a r e r e c o n s t r u c t e da n do r i g i no ft e t r a p l o i d sc l i n t o n i au n d e n s i sa n dt h er e l a t i o n s h i pa m o n g t h ep o p u l a t i o n sa r ed i s c u s s e d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fi t ss e q u e n c e su s i n gp a u p 4 0 b 4 as o f t w a r eo b t a i n e dt h em pt r e e s l e n g t h 1 0 5 6 c i o 6 3 0a n dr i o 6 8 4 i i w h e nt h eg a p sa r et r e a t e da sm i s s i n g t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed i p l o i dp o p u l a t i o n s a n dt e t r a p l o i dp o p u l a t i o n sf r o ms a m er e g i o na r ea l w a y sc l u s t e r e d t h eo r i g i no f c l i n t o n i au n d e n s i sp o l y p l o i d yi sp o l y t o p i c k e y w o r d s c l i n t o n i au d e n s i s p o l y p l o i d i t s c l o n e i i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 本人允许论文被查阅和借阅 本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 或其它 相关数据库 保密论文待解密后适用本声明 p 学位论文作者签名 盘坐倒 指导教师签名霆垄丝兰丝 即缪年厂月必日力妒孑年 月西日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 学位论文作者签名 唧玄q 么加争年r 月巧日 第一部分前言 1 东亚七筋姑的背景资料 r a f i na i t l e r m o n t h l ym a g a z 2 6 6 1 8 1 8 e ti nj o u m p h y s 8 9 1 0 2 1 8 1 9 多年 生草本 根状茎短 叶基生 全缘 花葶直立 花通常几朵 排成顶生的总状花 序或伞形花序 花较少或只具单花 花序轴和花梗在后期显著伸长 花被片6 离生 雄蕊6 着生于花被片基部 花丝丝状 花药背着 半外向开裂 子房3 室 每室有多颗胚珠 花柱明显 柱头浅3 裂 果实为浆果或多少作蒴果状开裂 种子棕褐色 胚细小 1 关于七筋姑属的分类曾经一度出现过争议 但目前已达成一致 全属共五个 种 其中cu d e n s i st r a u t v e tm e y 分布于东亚 cu n i f l o r a s c h u l t k u n t h 和c a n d r e w s i a n at o r r 分布于北美西部 cb o r e a l i s a i t r a 和cu m b e l l u l a t a m i c h x m o r o n g 分布于北美东部 呈典型的东亚一北美西部一北美东部间断分布 其中 北美4 个种均为四倍体 4 n 2 8 2 6 根据现有的细胞学研究资料表明 东亚七 筋姑cu d e n s i s 具有二倍体 2 n 1 4 和四倍体 4 n 2 8 两种细胞型 7 1 东亚七筋姑eu d e n s i st r a u t v e tm e y 根状茎较硬 粗约5 毫米 有撕裂成纤 维状的残存鞘叶 叶3 4 枚 纸质或厚纸质 椭圆形 倒卵状矩圆形或披针形 长8 2 5 厘米 宽3 1 6 厘米 无毛或幼时边缘有柔毛 先端骤尖 基部成鞘状抱 茎或后期伸长成柄状 花葶密生白色短柔毛 长1 0 一2 0 厘米 果期伸长可达6 0 厘米 总状花序有花3 1 2 朵 花梗密生柔毛 早落 花白色 少有淡蓝色 花 被片距圆形 长7 1 2 毫米 宽3 4 毫米 先端钝圆 外面有微毛 具5 7 脉 花 药长1 5 2 毫米 花丝长3 5 毫米 子房长约3 毫米 花柱连同浅3 裂的柱头长 3 5 毫米 果实球形至距圆形 长7 1 2 毫米 宽7 1 0 毫米 自顶端至中部沿背 缝线作蒴果状开裂 每室有种子6 1 2 颗 种子卵形或棱形 长3 4 2 毫米 宽约 2 毫米 花期5 6 月 果期7 1 0 月 1 全草可以入药 性味苦 微辛 凉 具有 祛风败毒 散瘀止痛的功效 可用于跌打损伤 劳伤 8 东亚七筋姑cu d e n s i st r a u t v e tm e y 分布自喜马拉雅 经中国的云南 四川 陕西 甘肃 湖北 河南 山西 河北 内蒙古 辽宁 吉林 黑龙江到朝鲜 日本和俄罗斯的远东地区 分布区大约在北纬2 5 5 0 0 东经7 9 0 一1 4 5 范围之 内 其中二倍体的分布从中国西南的云南一直延伸到俄罗斯的滨海边区 四倍体 除分布在中国云南及其以西的喜马拉雅地区 日本和萨哈林岛以外 在陕西南部 化龙山北坡海拔2 2 0 0 米以下的阔叶林或针阔混交林下和湖北木林子较狭的范围 内也有分布 常常生长在高山疏林下或阴坡疏林下 海拔9 0 0 4 0 0 0 米 9 1 2 东亚七筋姑的研究进展 形态学方面的研究表明 在东亚cu n d e n s i s 种内 叶 果实 花序和花粉 等形态特征变异复杂多样 但反映不出倍性上的差异 显示出该种目前正处于强 烈的分化阶段 从地理分布上 似乎从喜马拉雅地区一陕西南部 七筋姑的形态 特征变异比较复杂 而从秦岭一东亚东北部 形态特征变异比较单一 反映出喜 马拉雅地区一陕西南部可能是该类群变异和分化比较活跃的一个地区 七筋姑植物的花粉外壁纹饰具有三种类型 芽孢型 拟网状芽孢型 具穿 孔芽孢型 花粉外壁纹饰演化的主要途径可能是 芽孢型哼芽孢部分连接或融合 并有穿孔形成呻芽孢进一步融合 穿孔进一步扩大 形成拟网状芽孢型 拟网状 网状 1 0 1 种皮纹饰可以分为4 种类型 纹饰有细短的纵条纹组成 轻微波状 条纹间呈条穴状深陷 纹饰不规则条纹状 扭曲 相互交错联合 中间凹陷成沟 穴状 纹饰由凹陷的孔穴和稍隆起的脊组成类似于网穴状的结构 排列较有规则 纹饰由粗大明显的肋状突起组成 突起之间深陷呈纵向的构 肋上为细密的小穴 状或细条纹状结构 1 1 七筋姑植物适生于较高海拔的森林环境下 要求相对阴湿 凉爽的生境条件 其不但具有适生于干山环境的方式 而且其叶表皮结构自然表 现出阴生植物的一般特征 如叶表皮光滑无毛 晶体含量少 角质层很薄 气孔 密度较小 极少下陷 没有保护物围绕等 上表皮细胞5 7 边形 近等径或狭 长 下表皮细胞长条形 垂周壁向外隆起 平直 有明显加厚或加后不明显 平 周壁内陷 平滑具浅坑 有时具细条纹状纹饰或细小突起 气孔器散生于下表皮 无规则型 长度约为表皮细胞的1 4 1 3 隆起于表皮细胞或有时下陷 叶 表皮纹饰 平周壁 有平滑具浅坑到波状起伏具浅坑或细条纹状纹饰 12 1 气孔 大小的分化比较明显 平均长度从7 1 6 1 l o g m 不等 花序类型上 七筋姑植物 2 一般为总状花序 但其变异也较大 一株植物上花的数目可以从1 到多数 最多 可达2 3 朵 且花序靠近顶部的花有呈伞形花序的趋势 即使在同一种群内这种 变化也非常明显 无规律可循 李思锋等 7 对七筋姑属的细胞地理学研究表明 七筋姑属的染色体基数为 x 7 并非以往认为的1 4 东亚七筋姑具有两种倍性 2 n 1 4 的二倍体和4 n 2 8 的四倍体 不同地区 不同居群的二倍体核型虽然或多或少的有点差异 但总体 上还是比较一致的 四倍体居群中 处于陕西南部的化龙山居群和处于分布区两 端的四倍体居群有一定的差异 但这差异也仅仅是一对染色体属 v 型还是 j 型 从细胞学的角度看 核型上比较原始的二倍体仅仅在东亚发现 比较进化的四倍 体在东亚和北美均有分布 东亚应该是七筋姑属的起源地 北美是该属的次生分 化中心和现代分布中心 他认为七筋姑多倍体的起源是一种异地多起源 至少存 在3 个起源中心 1 中国西南山地起源 向西沿喜马拉雅山地扩散 2 东 亚东北部起源 并向东散布 通过白令陆桥迁移到达北美 3 东亚中部 陕西 化龙山 起源 k a z u h i k o 等 1 3 用c a r d i o c r i n u mc o r d a t u m s c o l i o p u sb i g e l o v i i s c o l i o p u sh a l l i i 和m e d e o l av i r g i n i a n a 做外类群 对5 个种的叶绿体基因r b c l 和m a t k 的测序结 果进行分析 进一步证实了七筋姑属为一单起源类群 属内的5 个种中 北美四 种亲缘关系较近 东亚种则位于进化树的基部 即东亚种在属内更为原始 王神玲等 1 4 采用i s s r 分子标记 对东亚七筋姑c l i n t o n i au d e n s i s1 7 个居 群的遗传多样性与遗传结构进行了研究 研究表明 东亚七筋姑不同的居群有着 较高的遗传多样性 分析结果也显示遗传变异主要发生在居群之间 8 1 4 7 而居群内部的遗传变异仅为1 8 5 3 七筋姑居群间的基因流n m o 2 2 0 0 远 远低于一般广布种植物的基因流 n m 1 8 8 1 七筋姑分布范围广以及其进化 历史是其具有高遗传多样性的原因 居群间存在较高遗传变异可能是由于七筋 姑本身的生物学特性 有限的基因流以及遗传漂变等原因造成的 郭副 利用 s s r 分子标记 对东亚七筋姑的遗传多样性及遗传分化进行了分析 得出了比较 相似的结果 s h a n n o n 多样性指数 n e i 信息多样性指数以及a m o v e 分析结果 均显示七筋姑居群具有类似的遗传结构 9 9 以上的遗传变异存在于居群间 居 群内的遗传变异不足1 表明七筋姑居群间存在明显的遗传差异和分化 由于 使用的叶绿体分子标记 基于n e i 遗传距离计算得到的基因流 n m 仅为0 0 0 2 8 单倍型的统计结果也显示 大多数单倍型只存在于某一特定群体中 少数单倍型 存在共享现象 这从另一方面支持了东亚七筋姑的遗传分化主要发生在居群间 斑块状的分布格局和有限的花粉流和种子流 可能导致了东亚七筋姑居群间明显 的遗传分化 3i t s 序列在被子植物进化中的应用 随着科学技术的发展 科学家们己常规地使用生物大分子 蛋白质和核酸 的遗传信息来探究生命的历史和有机体的进化关系 随着分子生物学理论和技术 的突飞猛进以及信息时代的到来 人们已将收集到的浩如烟海的分子数据整合到 比较形态学 细胞学 系统学 生态学 古生物学和居群遗传学并加以比较与综 合 使得这些历史悠久的古老学科变得生机勃勃 l6 1 随着2 0 世纪9 0 年代后p c r 技术广泛的应用 d n a 多态性可以通过体外克 隆的方法快速 高效而灵敏地检测出来 于是d n a 指纹分析不仅局限于杂交的 方法 许多新的策略相应产生 如基于p c r 的p c r r f l p r a p d s s r i s s r 和a f l p 等新的d n a 指纹技术得到了飞速的发展 1 7 在前些年的分子系统学研究中 多涉及到核5 8 s 1 8 s 2 6 s 核糖体d n a 线粒体d n a 和叶绿体d n a c p d n a 的酶切位点和序列变异 其主要的原因 就是这些d n a 序列相对比较保守 扩增引物有着比较广泛的适用性 扩增比较 容易 虽然c p d n a 被广泛的应用于探讨科及科以上分类阶元的系统发育关系 并将在这方面的研究中继续发挥重要作用 l8 1 但由于c p d n a 的进化速率远低于 核基因组 1 9 这就限制了其在低级分类阶元 如属 亚属 甚至种下居群间 的应 用 尤其是对于关系非常密切及近期才发生分化的分类群 此外 c p d n a 是细 胞质d n a 是通过母系单向遗传的 基于c p d n a 的系统发育关系研究就往往不 能反映物种间的进化方向 无法解决高等植物中广泛存在的杂交和多倍化现象 2 0 o 在高等植物中 核糖体d n a 是高度重复串联序列 1 8 s 5 8 s 2 6 s 连接 在一起 作为一个转录单位 t r a n s c r i p t i o nu n i t 称为顺反子 c i s t r o n 1 8 s 2 6 s r d n a 在植物中有一至数个位点 2 1 2 3 拷贝数可达到5 0 0 4 0 0 0 0 个 2 4 1 基本结构 4 如图1 1 所示 由1 8 s 5 8 s 2 6 s 和位于三者之问的内转录间隔区 i n t e m a l t r a n s c r i b e ds p a c e r i t s 组成 i t s l i t s 2 分布1 8 s 5 8 s 2 6 sr d n a 之间 而 1 8 s 5 8 s 2 6 sr d n a 的序列又非常保守 因此 可以应用与他们序列互补的通 用引物来对i t s 区进行p c r 扩增和测序 目前研究中所应用的引物多是根据 w h i t e 等设计的或是对已发表的引物做适当的改良 d b 圉1 1 楗物1 8 s 2 6 8r d n a 的基本结构 镑头示p c i 扩增和灏序弓i 物f 仿w e n d e l a 1 1 9 9 5 f i i 1 1 1t h es t r u c t u r eo f1 8 s 2 6 5r d n a 缸p l a n t s t h e 口r o w sd e n o t ei h ep r i m e r su s e df o rp c ra m p l i f i c a t i o na n ds 黼n c i n g 5 g g a a g t a a a a g t c g t a a c a a g c b 5 t c c t c c t c c g c t t a t t 7 0 则认为构建的进化树较为可靠 如果b o o t s t r a p 的值太低 则有可能进化树 的拓扑结构有错误 进化树是不可靠的 5 研究目的和意义 杂交和多倍化是植物最重要的进化方式之一 在自然界中 多倍化是一个 普遍存在的现象 7 0 9 6 的被子植物进化史上都曾经经历过多倍化过程 近年来 随着分子生物学在系统与进化植物学中的广泛应用 关于多倍体的研究渐渐的由 外部形态 生化特性 细胞学研究深入到分子水平 本研究中七筋姑属为典型的东亚一北美西部一北美东部间断分布 其北美四 个种只有四倍体一种细胞型 而分布于东亚的cu d e n s i s 具有2 n 1 4 和4 n 2 8 两 种细胞型 为典型的多倍体复合体 由于东亚七筋姑不同细胞型共存 两种细胞 型的分布区相邻或者重叠 为我们研究多倍体的起源 进化和迁徙提供了良好的 材料 目前对于东亚七筋姑的研究工作主要集中在形态学 细胞地理学和基于叶 绿体基因的分子系统学研究 由于叶绿体基因本身属于母系遗传 不能v 1 z 艮好的解 释杂交和多倍化现象 因此 本研究通过对n r d n ai t s 序列的系统发育分析 为东亚七筋姑的分子系统学和多倍体起源提供补充和证明 6 第二部分材料与方法 1 试验材料 1 1 植物材料来源 研究所用植物材料于2 0 0 4 年5 8 月和2 0 0 6 年5 8 分别采自陕西太白山 佛坪 镇坪 甘肃寨科桥 四川峨眉山 湖北神农架 木林子 天生桥 云南中 甸 丽江 西藏 河北雾灵山 辽宁白石砬子 老秃顶子 吉林 长白山 黑龙 江大亮子河 等1 0 个省区和日本北海道 覆盖了七筋姑在中国除山西外所有的 分布区 野外采集新鲜 完整的植物幼嫩叶片 用变色硅胶迅速干燥 硅胶变色 后需马上更换 直到叶片完全变干 带回实验室整理后 置于一8 0 冰箱保存备 用 同时在每个采样点采集土样及七筋姑植物的根尖 用f a a 固定液固定 带 回实验室进一步处理 表2 1 东亚七筋姑材料来源 t a b l e2 1l o c a l i t i e so fs a m p l e so fc u d e n s i s 1 2 配韦0 试齐 j 1 2 1 植物总d n a 提取试剂配制 1 预处理液 t r i s h c i p h 8 o e d t a n a c l 巯基乙醇 2 c t a b 裂解液 t r i s h c i p h 8 o e d t a n a c l c t a b 3 t e 缓冲液 t r i s f i c i p h 8 o e d t a 4 r n a s e a 溶液 r n a g e a 啊s h c i p h 7 5 8 1 0 0 m m o 儿 5 0 m m o 儿 2 5 0 m m o l l 2 1 0 0 m m o 儿 5 0 m m o l l 1 4 m o l l 2 1 0 m m o 儿 l m m o 儿 1 0 m g m 1 10 m m o l l 1 2 2p c r 片段克隆试剂配制 1 l b l u s i a b e r t a n i 液体培养基 细菌培养用的酵母提取物 y e a s te x t r a c t 5 9 细菌培养用的胰蛋白胨 b a c t op e p t o n e 1 0 9 n a c l 1 0 9 d d h 2 0至1 0 0 0 m l 用5 m o l l n a o h 约1 2 m l 调节p h 值至7 4 加入去d d h 2 0 至总体积为 1 l 1 0 3 4 x1 0 5 p a 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 室温冷却至5 0 c 加入抗生素 根据实 验需要 2 l b 固体培养基 参照l b 液体培养基配制的方法 加入3 的琼脂粉 3 氨苄青霉素 1 9 氨苄青霉素 a m p 溶于1 0 0 m l 无菌水中 过滤除菌后分装 最终浓度 为1 0 0 m g m l 2 0 c 保存备用 1 2 3 质粒提取试剂配制 1 s t e 2 溶液i 3 溶液i i n a c l t r i s c 1 p h 8 0 e d t a 葡萄糖 t r i s c 1 p h 8 0 e d t a n a o h 0 1 m o l l 1 0 m m o 儿 l m m o 忱 5 0 m m o 儿 2 5 m m o l l 1 0 m m o 儿 0 4 m o l l s d s1 该试剂需要新鲜配制 配制后将n a c l 和s d s 按1 1 的比例混合 9 4 溶液i i i 2 试验方法 5 m o 儿k a c 冰醋酸 h 2 0 2 1 染色体数目的计数 6 0 m l 1 1 5 m l 至1 0 0 m l 1 固定取出预处理的各个采样点七筋姑植物的根尖 投入c a m o y 液中固 定2 2 4 h 换入7 0 酒精 暂时保存 2 水解把根尖投入预热的5 8 6 0 cl m o l l 热h c l 中 恒温条件下水解 1 4 1 5 m i n 3 染色倒去h c l 加入s c h i f r 试剂 无色品红 少许 染色0 5 1 h 或者 在冰箱内染色1 2 2 4 h 4 漂洗吸去s c h i f f 试剂 用漂洗液换洗2 3 次 每次1 2 m i n 5 洗涤倒去漂洗液 加蒸馏水 用吸管换洗几次 6 压片在载玻片上切取根尖着色深的部位 滴一滴4 5 醋酸 盖上盖玻 片 其上放一片吸水纸 做手指压柱吸水纸的左边 右手指从吸水纸的左端向右 方轻轻抹去 在用铅笔擦头从盖片上轻轻敲打 使细胞均匀散开 7 镜检把压好的片子放显微镜下 先观察细胞分散状况和中期分裂相的多 少 在检查分裂中期细胞中的染色体是否完全散开 如若染色体分散不好而难以 分辨和计数 可取下片子 平放在桌面上 用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压 力 然后观察 计数 照相 2 2d n a 的提取与纯化 2 2 1 植物总d n a 的提取 在东亚七筋姑总d n a 的提取中 我们发现可能由于东亚七筋姑植物叶片中 含有较多的影响d n a 提取的次生代谢产物 3 4 1 按照传统的c t a b 法提取 效果 1 0 非常差 得到的d n a 沉淀多为黑色或者红褐色 严重的影响p c r 的结果 在本 研究中 我们将叶片研磨后 加入预处理液洗涤两次 可以明显的看出洗涤后的 预处理液颜色发红褐色 通过两次洗涤可以去除大量的细胞质中所含的次生代谢 物质 d n a 提取的效果很好 d n a 的提取采用改良c t a b 法 1 取o 5 9 冷冻无病斑叶片 o 3 9 硅胶干燥叶片 置于预冷研钵中 加入 适量聚乙烯吡咯啉酮 p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e p v p 抗坏血酸 v c 及石英砂 研磨成粉末 2 将干粉装于2 0 m le p p e n d o r f f 管中 约占管内总体积的1 3 加入预处 理液l m l 充分混匀 使材料与预处理液完全接触 冰浴1 0 m i n 3 取出e p p e n d o r f f 管 6 0 0 0 r p m 离心4 m i n 弃去上清液 4 重复 2 3 步骤一次 5 加入预热至6 5 c 的c t a b 提取液8 0 0 1 充分混匀 使材料与提取液完 全接触 6 5 c 水浴9 0 m i n 其间每隔1 0 1 5m i n 轻微震荡一次 6 取出e p p e n d o r f f 管稍冷却 1 0 0 0 0 r p m 离心4 m i n 取上清液 约6 0 0 1 加入2 4 0 1 醋酸钠 3 m 以及8 0 0 1 氯仿 异戊醇溶液 体积比2 4 1 充分混合 后 于0 c 放置3 0 m i r a 7 1 0 0 0 0r p m 离心4 m i n 取上清 加入等体积的氯仿 异戊醇溶液 体积 比2 4 1 再抽提一次 8 上清液加入二倍体积预冷的异丙醇 一2 0 2 0 c 条件下放置1 5 h 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集沉淀 7 每管加l m ld n a 洗涤液 室温作用3 0 m i n 2 0 0 0r p m 离心5 m i n 弃上 清 8 加入7 0 乙醇溶液l m l 5 m i n 后弃去乙醇 自然风干 9 加入适量0 1 x t e 溶解基因组d n a 短期使用置于4 c 长期置于 2 0 备用 2 2 2 d n a 纯度检测 2 2 2 1 电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组d n a 纯度 6 i d n a 样品与2 1 点样染 料混合均匀 用0 8 琼脂糖凝胶 0 5 e b 1 x t b e 电压6 0 v 电泳6 0m i n 用凝胶成像系统照相 根据电泳条带的整齐度 点样孔中荧光的有无估计d n a 的纯度 图2 1 东亚七筋姑植物基因组d n a 纯度检测 f i g 2 1p u r i 妙d e t e r m i n a t i o no fg e n m i cd n ao fcu d e n s i s 2 2 2 2 分光光度计检测 采用德国产蛋白核酸分析仪 e p p e n d o r fb i o p h o t o m e t e r 测定2 3 0 n m 2 6 0 n m 2 8 0 n m 处的光吸收值 根据a 2 6 0 a 2 8 0 比值及a 2 3 0 的值确定d n a 纯度 a 2 6 0 a 2 8 0 1 8 1 9 意指高纯度的d n a a 2 6 0 a 2 8 0 1 9 2 0 意指高纯度的r n a a 2 6 0 a 2 8 0 小于1 8 说明有蛋白质污染 在2 3 0 n m 处的吸收反映了样品被酚或尿 素污染 根据2 6 0 n m 处的光吸收值估测样品d n a 的浓度 1 a 2 6 0 5 0 n g p l d s d n a 将模板d n a 稀释到5 0 n g l 待用 2 3i t s 片段的扩增和回收 引物参照w h i t e 3 5 i t s 通用引物i t s 4 5 一3 t c c t c c g c t t a t t g a t a t g c i t s 5 5 一3 g g a a g t a a a a g t c g t a a c a a g g 扩增全长i t s 包括5 8 s 区域 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 以东亚七筋姑基因组d n a 为模板 用表2 的p c r 扩增体系进行扩增 表2 2p c r 反应体系 2 0 9 1 反应组分用量 p l 1 0 9 m p 2 1 0 9 m 模板d n a 5 0 n g 9 1 t a q 酶 0 5 u 1 o 5 9 l 1u l 0 6 9 l 10 x t a qb u f f e r m 9 2 p l u s d n t pm i x t u r e d d h 2 0 2 9 l 0 6 9 l 1 4 8 9 l p c r 反应条件如下 9 5 5 m i n 9 4 6 0 s e e 5 6 c 4 5 s e e 7 2 9 0 s e e 7 2 7 m i n 3 0c y c l e s p c r 反应结束后 用1 5 琼脂糖凝胶电泳分离目的条带 然后利用润德公 司d n a 回收试剂盒纯化回收p c r 产物 具体操作步骤如下 1 切取含目的片段的琼脂糖 捣碎按重量比1 3 加入e x t r a c t i o nb u f f e r 溶液 2 5 5 水浴1 0 m i n 期间可振荡助溶 3 将溶液置于离心柱中 于6 0 0 0 r p m 离心6 0 s e c 4 倒掉液体 加5 0 0 i t le x t r a c t i o nb u f f e r 溶液于离心柱中1 2 0 0 0 r p m 离心 3 0 6 0 s e e 弃液体 5 向离心管内加入6 5 0 9 lw a s hb u f f e r 于1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 6 0 秒 弃液 体 6 1 2 0 0 0 r p m 再次离心l m i n 甩干剩余液体以除去残余酒精 7 将离心柱置于新的离心管中 室温敞开离心管盖5 1 0 m i n 使乙醇挥 发殆尽 8 加入2 0 3 0 m le l u t i o nb u f f e r 溶液 5 5 c 水浴 静置2 m i n 9 1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n 管底溶液即为所需d n a 1 0 1 2 琼脂糖凝胶电泳检验回收片段大小和浓度 1 1 贮存于 2 0 保存备用 2 4i t s 片段的克隆和阳性克隆检测 2 4 1 大肠杆菌感受态细胞的制备 用于转化的大肠杆菌菌株为t o p1 0 感受态细胞的制备的过程如下 1 单菌落 接种于5 m ll b 液体培养基中 3 7 c2 5 0 r p m 培养过夜 2 将过夜培养物接种于5 0 m ll b 液体培养基中 3 7 c 快摇3 h 使 菌液密度氏o o 驾 4 3 将菌液转移至5 0 m l 的离心管中 4 c 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 4 用1 5 m l 缓冲液a 重悬菌体 冰浴1 h 5 4 c 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 弃上清 6 用2 m l 缓冲液b 重悬菌体 冰浴1 5 m i n 分装菌液 每e p 管中2 0 0 1 7 0 c 保存备用 2 4 2 连接反应 连接反应体系为 回收的d n a 片段4 o w l p m d l 8 一tv e c t o r 1 0 w 1 l i g a t i o ns o l u t i o n5 0 w 1 t o t a l10 0 w 1 混匀反应物 快速离心 1 6 过夜 2 4 3 连接产物的转化 1 取3 1 连接产物加在分装好的大肠杆菌感受态细胞中 轻轻混合 在冰上 放置3 0 m i n 2 4 2 热休克9 0 s 置于冰上1 2 m i n 3 每管加无抗生素的l b 液体培养基8 0 0 1 3 7 c 摇床快摇l h 4 用无菌玻璃铺菌器将2 0 0 1 菌液铺于含相应抗生素的琼脂平板表面 加入 4 0 1x g a l 和8 1i p d g 3 7 c 平放2 0 m i n 倒置培养1 旺1 4 h 5 次日观察平板兰白斑生长情况 检测转化率 1 4 2 4 4 阳性克隆的初步鉴定 挑选白色菌落 只需要挑取少许克隆 在配好的p c r 反应液中涮几下 以 i t s 片段p c r 体系进行扩增 并以基因组d n a 为阳性对照 d d h 2 0 为阴性对照 进行检测 2 4 5 重组质粒的筛选与鉴定 1 从l b 平板上挑取单菌落 接种于5 m l 附加相应抗生素的l b 液体培养基 中 3 7 c 2 5 0 r p m 振荡培养过夜 至对数生长后期 2 取1 2 1 5 m l 菌液移至1 5 m l 无菌e p 管中 1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s 弃去上清 液 必要时可再离心3 0 s 弃去上清液 3 加入l m ls t e 溶液 涡旋振荡重悬菌体 1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s 弃去上清液 用无菌吸水纸吸去管壁上的液滴 4 重复 3 操作一次 5 向离心管内加入1 0 0 1 冰冷的溶液i 涡旋振荡悬浮菌体 6 加入2 0 0 1 新配制的溶液 迅速盖严离心管 快速颠倒 千万不要振荡 离心管5 次 室温放置5 m i n 7 向离心管内加入1 5 0 1 溶液i i i 颠倒离心管1 0 次 置冰水浴中5 1 0 m i n 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 8 将上清液转入1 5 m l 无菌e p 管中 加入1 1 0 体积r n a s e 3 7 c 保温1 h 至 过夜 9 分别用1 v 的t r i s 平衡酚 酚 氯仿 氯仿抽提1 次 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 1 0 加2 v 无水乙醇 2 0 放置3 0 m i n 1 1 4 c 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 弃去上清液 用无菌吸水纸吸去管壁上的液 滴 1 2 用5 0 0 17 0 7 醇洗沉淀1 3 次 空气中干燥 1 3 加入适量 1 0 2 0 1 t e 溶解质粒d n a 电泳检测纯度 紫外吸收法测 定含量 2 4 6 重组质粒的p c r 检测 检测 以p m d1 8 t 通用测序引物m 1 3 为引物 用以下体系对重组质粒进行p c r h 2 0 b u f f e r d n t p 上游引物 2 0 p m o l 1m 1 3 下游引物 2 0 p m o l lm 1 3 1 b t a 1 1 5 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 0 m p c r 反应程序为 9 4 c 5 m i n 9 4 cl m i n 5 6 cl m i n 7 2 c 2 m i n 3 0 个循环 7 2 c1 0 m i n 用1 5 琼脂糖凝胶电泳检验p c r 结果 2 5 序列测定 将转化成功的菌株做穿刺培养 送于上海生工生物工程技术服务有限公司做 正反向测序 测序引物为p m d1 8 t 通用引物为m 1 3 1 6 第三部分结果与分析 1i t s 目的片段的扩增和片段的克隆 应用经过优化的p c r 扩增体系对不同居群东亚七筋姑r d n ai t s 片段进行扩 增 得到单一的片段条带 如图3 1 所示 目的片段长度约为6 0 0 b p 左右 123456m12345 6 7 89 1 0c km 图3 1p c r 产物电泳图 f i g 1a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so fp c rp r o d u c t s 注 m 为m a k e rd l 2 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 b p 1 2 3 4 5 6 为不同居群的东亚七筋姑样品 图3 2 重组质粒p c r 扩增检测 f i g2i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i db yp c r a m p li f i c a t i o n 注m 为m a k e rd l 2 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 b p 1 5 为 白 色菌落 6 1 0 为蓝色菌落 c k 为阴性对照 将纯化