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7 生命科学仪器 2 0 0 8 第 6 卷 2 月刊 综述 1 前言 蛋白质和肽类分子的化学修饰已经成为生物技术 与生物医学领域的研究热点 目前用作蛋白质的修饰 剂很多 如聚乙二醇 右旋糖苷 聚乙烯吡咯烷酮 聚 氨基酸 多聚唾液酸等 而聚乙二醇 P o l y e t h y l e n e g l y c o l P E G 则是应用最为广泛的大分子修饰剂之一 聚乙二醇修饰又称分子的P E G 化 是目前分子变 构化学最重要的技术之一 是用来解决或缓解蛋白和 多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径 P E G 是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料 分子组 成为 H O C H 2 C H 2 O C H 2 C H 2 O n C H 2 C H 2 O H P E G的 分子量范围是 6 K D到 1 7 0 K D 1 P E G分子末端有两个能被活化的 O H基团 化 学修饰时则多采用甲氧基聚乙二醇 P E G 的衍生物 为修饰剂 多数情况下P E G 衍生物与蛋白质的共价结 合是以蛋白质分子上的氨基作为修饰位点 这主要是 因为氨基具有亲核性 并且大多存在于蛋白质分子的 表面 1 P E G链还可以与马来酸酐进一步共聚形成梳 状的 P E G衍生物 简称 P M P E G分子中存在的大量 乙氧基能够与水形成氢键 使 P E G具有良好的水溶 性 分子末端剩余的羟基通过适当方式活化后可与各 类蛋白分子相偶联 而且P E G 无毒 具有良好生物相 容性和血液相容性 其生物相容性已通过美国食品和 药物管理局 F D A 认证 3 特别是当蛋白质经过P E G 类修饰剂修饰后 修饰剂的许多优良性质也会在修饰 蛋白中得到体现 对于各种具有药用潜能的蛋白来说 采用P E G 修饰的目的主要有以下三个方面 1 增加稳 定性 延长血浆半衰期 2 降低免疫原性和抗原性 3 降低毒副作用 4 2 P E G修饰反应 2 1 P E G修饰剂的分类 2 1 1 P E G琥珀酰亚胺类衍生 P E G 的N 羟基琥珀酰亚胺酯类在p H 值为7 9 时 可以直接与蛋白质上的氨基反应 将P E G 上的羟基衍 生为羧基 最常用途径是通过羟基与琥珀酸酐反应 所得衍生物为 P E G琥珀酰亚胺琥珀酸酯 2 2 1 2 P E G氨基酸类衍生物 通过 P E G 与正亮氨酸的 氨基或赖氨酸上的 氨基和 氨基反应制备出P E G 的氨基酸类衍生 物 P E G 的氨基酸类衍生物可以通过 羟基琥珀酰 亚胺进一步活化 2 2 1 3 P E G三嗪类衍生物 这类修饰剂包括活化的 PEG1 2 O m e t h o x y p o l y e t h y l e n e g l y c o l 4 6 d i c h l o r o s t r i a z i n e 和 P E G 2 2 4 b i s O m e t h o x y p o l y e t h y l e n e g l y c o l 6 c h l o r o s t r i a z i n e 三聚氰酰氯上的氯原子与 P E G 上的羟基反应可以得到活化的P E G 1 和P E G 2 活化的 P E G 1 和P E G 2 上的游离氯原子可以分别在p H 值为8 9 和 9 5 1 0 时与蛋白质的氨基反应 2 往往用 P E G 2 修饰蛋白质的效果要更好 可以在较低的修饰程度下 获得免疫原性产物 其生物活性保留比用 P E G 1 修饰 的要明显提高 5 2 1 4 梳形 P E G衍生物 P E G与马来酸酐形成的共聚物 缩写形式为P M 具有多个反应位点 呈梳形结构 目前 已经制备出两 种活化的P M共聚物 即活化P M 1 3 相对分子质量M 1 3 0 0 0 8 n 3 3 R H 和活化P M 1 0 0 相对分子 质量 M 1 0 0 0 0 0 m 5 0 n 4 0 R C H 3 2 2 2 P E G修饰反应的类型与途径 最常用的修饰反应是亲电活化的P E G 修饰剂与赖 氨酸的 氨基或蛋白质 末端的氨基反应 典型 蛋白质的P E G修饰 刘广林 白城市第一中学 吉林省 白城市 1 3 7 0 0 0 摘要蛋白质的化学修饰作为改善蛋白质的物理化学和生物学特性的有效手段 已经得到了越来越多的研究和开发 本文简述了蛋白质P E G修饰的研究概况 涉及P E G化学修饰反应的类型和影响因素 P E G修饰蛋白的性质 应用及局 限性 关键字蛋白质 化学修饰 P E G 作者简介 刘广林 1 9 5 4 白城市第一中学 高级教师 从事生物化学方面研究 8 生命科学仪器 2 0 0 8 第 6 卷 2 月刊 综述 的 P E G修饰剂和修饰反应形成的连接键类型有 羟基琥珀酰胺脂类 N H S 酯酰胺键 环氧化类 烷基 键 羰基咪唑类 尿烷键 硝基苯基碳酸酯类 尿烷键 三氟乙基磺酸酯类 烷基键 醛类 末端 s c h i f f 碱 P E G 修饰剂通过伯胺基团与蛋白质的反应 常常 会形成不均一的偶合物 不均一主要是指蛋白质分子 中同一基团被某一修饰剂修饰时 其化学反应性不相 同以及不同的基团可以与同一种修饰剂发生同一性质 的反应 为改进修饰的不均一性 对蛋白质表面的其 它官能团进行修饰的方法也有大量的研究报道 这些 官能团主要包括游离的半胱氨酸 寡糖 羟基等 用 作修饰特殊位点的P E G 衍生物有 乙烯基磺酸 修饰 游离的半胱氨酸 碘乙酰胺 修饰游离的半胱氨酸 马来酰胺 修饰游离的半胱氨酸 正吡啶二硫化物 修饰游离的半胱氨酸 酰肼 修饰寡糖 异氰酸酯 修饰羟基或氨基 3 2 3 P E G修饰反应的影响因素 影响 P E G修饰过程的主要因素有 蛋白质浓 度 蛋白质与 P E G修饰剂的摩尔比 修饰反应的 p H值和离子强度 修饰反应温度 修饰反应持 续时间 3 蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件 除允许 修饰过程能够顺利进行外 还必须满足如下要求 一是不引起蛋白质的不可逆变性 二是有利于选择性 地修饰蛋白质 为此 反应物配比 反应 温度和反应介质等都要控制在一定的范围 在所有影响蛋白质分子的化学修饰反应的条件 中 值是最重要的一个条件 因为它决定了具 有潜在反应能力的功能基所处的可反应和不可反应的 离子状态 一般情况下 增加 可以提高反应速 率 降低 可以减小反应速率 反应活性较高的 修饰剂可以在生理 下与蛋白质耦合 而反应活性 较低的修饰剂通常需要较高的 而修饰反应的专 一性则对应有一个优化 值 通过改变修饰剂与蛋 白质的摩尔比和改变 可以迅速地给出对应于特定 修饰度的实验条件 温度也是一个必须要注意的条件 因为温度可以 影响到活性巯基的微环境 恰当选择温度可以减少或 防止一些竞争的基团反应 有些蛋白质属于热敏性蛋 白质 修饰反应需要在较低温度下进行 在此情形 下 反应时间要适当延长 反应介质可改变蛋白质 的构象或封闭反应部位 因而影响修饰反应 2 3 P E G修饰蛋白的性质 3 1 免疫原性 免疫原性 P E G修饰后的蛋白质的免疫原性会有 显著的降低 当修饰度超过一定值时 免疫原性会消 失 3 3 2 循环半衰期 蛋白质经大分子修饰后 循环半衰期均有不同 程度的提高 S O D 经P E G 2 化后 半衰期从0 6 6 7 h 延 长到5 0 9 h 天冬酞胺酶被P E G 2 修饰后 半衰期从4 h 延长至 5 4 h 通过琉基 P E G化的 I L 2 突变体在循环 系统清除速率下降了 4 倍 5 3 3 稳定性 用水溶性大分子对蛋白质共价修饰后 蛋白质 的热稳定性 抗酸碱能力 抗变性剂能力及抗蛋白酶 水解能力都有明显提高 5 3 4 毒性 P E G 修饰后蛋白质的毒性一般都比未修饰后的蛋 白质的毒性低 但是使用低分子量的P E G 作为修饰剂 时 修饰蛋白有时还是存在一定毒性 静脉注射或肌 内注射少量P E G 时 并未观察到毒性 只有长期和大 量地使用 P E G时才有可能引发毒性 所以 P E G修饰 蛋白如细胞素 酶 荷尔蒙一般不会呈现毒性 3 3 5 活性 有些蛋白质经水溶性大分子修饰后 其生物活 性有不同程度的提高 如用右旋糖酐修饰核糖核酸 酶 其酶活性提高1 倍 右旋糖酐修饰糜蛋白酶 其 酶活性提高4 倍 另一些蛋白质经修饰后对活性影响 不大 如P E G 修饰过氧化氢酶 P E G 修饰脲酶等 其 酶活性均损失不大 但有的经修饰后 活性损失较大 如 PEG修饰 L 天冬酞胺酶 其酶活性仅保持 1 1 1 4 采用底物保护办法 酶活力可保持3 0 以 上 如果改用 N 羟基琥珀酰亚胺活性醋法 用P E G 修饰天冬酞胺酶 其酶活性可保留5 2 不少修饰蛋白质的药效明显提高 右旋糖酐修饰 的胰岛素明显高于天然胰岛素的作用 在M e t h A 纤维 瘤 B 1 6 黑素瘤和 P a n 0 2 胰腺癌移植动物模型中 P E G I L 2 的抗肿瘤活性高于 I L 2 天然S O D 2 0 0 U g 对琼脂引起的大鼠足肠肿胀无明显的抑制作用 而 同剂量的修饰S O D 则有极为明显的抑制作用 虽然天 冬酞胺酶经P E G 修饰 其酶活性损失严重 但其抗肿 瘤作用明显增强 白血病动物模型实验结果表明 天 然酶治疗组动物生存期与不用药组都是1 3 d 而修饰 酶治疗组动物生存期则为 4 6 d 9 生命科学仪器 2 0 0 8 第 6 卷 2 月刊 综述 4 蛋白质化学修饰的原理 蛋白质的化学修饰主要包括蛋白质分子的侧链基团 的改变和蛋白质分子中主链结构的改变两个方面 其 中前者研究较多 6 在2 0 种构成蛋白质的常见氨基酸 中 只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进 行化学修饰 根据化学修饰剂与药用蛋白质之间反应 的性质不同 修饰反应主要分为酰化反应 烷基化 反应 氧化还原反应 芳香环取代反应等类型 对 蛋白质进行巯基 氨基和羧基等侧链基团进行化学修 饰 1 修饰后的蛋白质在临床应用中显示出优良的性 质 其机理可能是 蛋白质化学修饰之后 修饰剂 与蛋白质分子偶联 使得蛋白质的分子量增大 空 间结构发生改变 当修饰后的蛋白质分子量达到或超 出肾小球滤过作用的阈值时 蛋白质随血液循环进入 肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用 因而可以在血液 循环中停留更长的时间 例如 重组白介素2 r I L 2 以小分子量的 P E G修饰 P E G H L 2 在小鼠体内 的清除时间较r I L 2 而言几乎不变 然而当P E G r I L 2 超过 7 0 K D后 其清除时间则延长了 1 0 倍 另一 方面 蛋白质进行化学修饰后 空间结构发生改 变 修饰剂作为一种屏障 将蛋白质表面的抗原决 定簇掩盖起来 使得蛋白质分子不能与各种细胞表面 受体结合 不被机体的免疫系统识别 避免了相应 抗体的产生 这是化学修饰降低药用蛋白免疫原性的 基本原理 同时 由于修饰剂的屏障效应 使蛋白 质不易受到各种蛋白酶的攻击 降解速率明显降低 有利于药用蛋白活性的发挥 1 5 P E G化化学 5 1第一代P E G化学 P E G化通常要在温和条件下进行 对于蛋白质 或肽类分子 常常参与反应的基团为 和 氨 基 用于蛋白质或肽类分子中的 或 氨基P E G 化的第一代 P E G衍生物 包括 1 P E G二氯三 嗪衍生物 2 P E G三氟乙基磺酸酯 3 P E G 琥珀酰亚胺碳酸酯 4 P E G苯并三唑碳酸酯 5 P E G对硝基苯碳酸酯 6 P E G三氯苯碳 酸酯 7 P E G碳酰咪唑 8 P E G琥珀酰亚 胺琥珀酸酯 7 5 2第二代P E G化化学 5 2 1 与氨基偶联的 P E G化化学 依据第二代P E G 化化学设计出的P E G 衍生物可以 较为有效地解决第一代P E G 衍生物作为化学修饰剂存 在的一些问题 如二醇杂质存在 仅局限于低分子 量 P E G 连接键不稳定 副反应多 选择性差 等 第二代 P E G衍生物的第一个例子是 P E G 丙 醛 它比 P E G 乙醛更易制备和使用 另一种利 用P E G 醛衍生物的方式是P E G 丙醛或P E G 乙醛通 过酸水解形成的乙缩醛水合物 5 2 2 半胱氨酸残基的 P E G化化学 带有游离巯基的蛋白质为数不多 但是 采用 基因工程手段把巯基引入到蛋白质中的特定位点后 就可以用对巯基呈现一定反应活性的P E G 对该蛋白 质进行高选择性修饰 由于蛋白质表面半胱氨酸残基 数比赖氨酸残基数要少得多 因此半胱氨酸是一个很 好的靶位 可以实现特异性修饰 7 此外 利用巯 基可进行不同类型的化学修饰 该途径的潜在缺点是 通过基因工程加入的游离半胱氨酸会增加形成不正确 二硫化物和蛋白质二聚的几率 5 2 3 糖类残基或 末端的 P E G化化学 糖类残基或苏氨酸及丝氨酸上的 末端的氧化 是蛋白质进行定点P E G 化的另一种方法 糖类可用 酶如葡萄糖氧化酶来氧化 或用高碘酸钠进行化学氧 化产生具有反应活性的醛基 这些醛基可与P E G 肼 反应生成腙或与P E G 胺反应生成可逆的S c h i f f 碱 用 硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物 而 S c h i f f 碱可以还原为仲胺 用 P E G 氨基进行还原性 烷基化存在的主要问题是 蛋白质上的氨基与 P E G 氨基具有相似的反应活性 这样就有可能形成交联聚 集体 此情况下 P E G 肼化物就更适于使用 虽 然在酸性条件下蛋白质的氨基主要呈质子化 但由于 P E G 肼化物的碱性比伯胺弱 所以反应的结果是选 择性地形成 P E G 腙 7 利用这个方法可以形成多个 偶合位点 但修饰位点只对糖类有特异性 5 2 4 可逆修饰的 P E G化化学 大多数 P E G 化化学的设计是使 P E G 与蛋白质之 间形成稳定的连接键 以利于偶联物的纯化和长期保 存 但有时P E G 会占据或屏蔽蛋白质的活性位点而降 低其活性 另外 P E G 偶联物分子量对于蛋白质的活 性有直接影响 分子量越大 则体外活性越低而体内 活性越高 7 5 2 5 异端双功能基 P E G化学 随着 P E G化化学研究的逐渐深入 合成异端双 功能基P E G 衍生物的要求就提了出来 这类衍生物在 1 0 生命科学仪器 2 0 0 8 第 6 卷 2 月刊 综述 用聚乙二醇修饰的蛋白质类药物表现为溶解度和 稳定性增加 免疫原性 抗原性和毒性减弱或消 除 药物代谢动力学性质改善 半衰期延长 并增 加药物的治疗指数 扩大临床使用等 从而克服蛋 白质类药物在临床应用中的不足 自 1 9 9 1 年 P E G修 饰的腺苷脱氢酶 P E D A D A 首次获F D A 认可以来 迄 今已有 4 0 多个 P E G修饰的蛋白药物被用于临床治疗 各种疾病 4 近年来 国外也有不少相关研究的报道 H G C h o i 等 9 研究了P D M S 经 P E G的表面修饰以及对于在 微观生物反应器中蛋白质吸附和细胞吸附的抗性表面 中的应用 据 G P a s u t 等 1 0 报道 P E G化技术已将蛋 白质改进转化成为非肽类药物 展开了另一领域的研 究 也已得到了越来越广泛的重视 并且在蛋白质 治疗学和非肽类药物两个领域里的例子都已见报道 B r a u n o v a A等 1 1 报道了 P E G修饰蛋白质在聚合物药 物 肿瘤治疗 药物载体 生物相容性等方面的研 究和应用 J o S 等 1 2 针对与P E G 分子的表面被公认为 阻碍蛋白质吸收 将 P E G分子的蛋白质排斥性能被 最大化的共价转换 合成出了多种 P E G衍生物兵分 别对其性能进行了研究 T s u n d o d a 等 1 3 对 T N F 的 P E G修饰方法进行了改进 即在与P E G反应前加入 解决这些问题 一方面可以通过对修饰反应条 件进行优化处理 确定最佳修饰度和产物的分子量 以便在延长血液廓清时间和保证适宜的扩散速度之间 求得平衡 另一方面 设计合成新的具有高选择性的 P E G 修饰剂也是非常必要的 以便控制修饰反应只发 生在生物大分子的某些特定部位上 避免和减少对生 物活性的影响 8 若能妥善解决这些问题 则蛋白质 和多肽类药物的开发和临床应用必将得到长足发展 参考文献 1 谢芳 朱欣华 邢自力 吴自荣 药用蛋白的化学修饰 J 生命 的化学 2 0 0 2 2 2 6 5 4 4 5 4 7 2 姜忠义 高蓉 许松伟 王艳强 蛋白质的化学修饰研究进展 J 现代化工 2 0 0 1 2 1 8 2 5 2 8 3 姜忠义 高蓉 许松伟 王艳强 药物蛋白的聚乙二醇修饰 J 中国药学杂志 2 0 0 2 3 7 6 4 0 9 4 1 2 4 付春晓 蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用 J 国外医学药学分册 2 0 0 1 2 8 2 7 8 8 1 5 王树歧 金晶 马淑哲 蛋白质的化学修饰与生化药物 J 中 国生化药物杂志 1 9 9 8 1 9 5 2 2 4 2 2 7 6 姜忠义 高蓉 许松伟 王艳强 高岩 蛋白质和多肽类药物分 子化学修饰的研究进展 J 中国生化药物杂志 2 0 0 2 2 3 2 1 0 2 1 0 4 7 姜忠义 许松伟 王艳强 蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化 P E G链的两端具有不同的两个末端基团 其通式为 X P E G 其中两个独立的功能基 和 可分别与 两个具有不同特性的大分子相连接 7 P E G骨架提供 了可溶性 生物降解性 柔顺性和连接单元 和 的一定自由度 6 P E G修饰蛋白质的应用及局限性 6 1 P E G修饰蛋白的应用 目前已经有多种蛋白质修饰后被用于生物医药领 域 如表 1所列 8 可逆性氨基保护剂二甲基马来酸酐 该法得到的中等 分子量P E G T N F 其体内活性是上述M P E G T N F 的 2倍 6 2 P E G修饰蛋白的局限性 P E G的修饰也存在某些问题 主要表现为 1 扩散速度受限 经P E G 修饰后 蛋白分子量显著增加 药物自血液向目标组织的输送速度受到限制 2 生物 活性降低 P E G 为链状高分子 在与蛋白表面特定基 团进行反应时 不可避免地会在一定程度上破坏或遮 蔽了蛋白表面的活性位点 造成其生物活性的降低 被修饰蛋白种类修饰目的用途 无基质牛血红蛋白延长血浆半衰期 降低肾毒性血液代用品 超氧化物歧化酶延长血浆半衰期 降低免疫原性清除氧自由基 治疗关节炎 天冬酰胺酶降低免疫原性治疗白血病 牛血清白蛋白降低免疫原性血浆扩容剂 白介素 2增加水力动力学半径治疗肿瘤 肿瘤坏死因子 增加抗肿瘤效能 降低毒副作用治疗肿瘤 抗肿瘤抗体肿瘤定位治疗肿瘤 葡糖苷酸酶抗体增加稳定性 改善药代动力学特性治疗实体肿瘤 表1 P E G修饰蛋白及其应用 1 1 生命科学仪器 2 0 0 8 第 6 卷 2 月刊 综述 化学 J 有机化学 2 0 0 3 2 3 1 2 1 3 4 0 1 3 4 7 8 徐静 聚乙二醇修饰蛋白质类药物的研究现状及展望 J 国 外医学预防诊断治疗用生物制品分册 2 0 0 4 2 7 2 7 5 7 8 9 H G C h o i Z Z h a n g P B o c c a z z i P E L a i b i n i s A J S i n s k e y K F J e n s e n P o l y e t h y l e n e g l y c o l P E G m o d i f i e d p l o y d i m e t h y l s i l o x a n e P D M S f o r p r o t e i n a n d c e l l r e s i s t a n t s u r f a c e s i n m i c r o b i o r e a c t o r C 2 0 0 3 I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n M i n i a t u r i z e d C h e m i c a l a n d B i o c h e m i c a l A n a l y s i s S y s t e m s 2 0 0 3 S q u a w V a l l e y C A U S 7 t h 1 1 0 5 1 1 0 8 1 0 G P a s u t A G u i o t t o F M V e r o n e s e P r o t e i n p e p t i d e a n d n o n p e p t i d e d r u g P E G y l a t i o n f o r t h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n J E x p e r t O p i n i o n o n T h e r a p e u t i c P a t e n t s 2 0 0 4 1 4 6 8 5 9 8 9 4 1 1 B r a u n o v a A P e c h a r M U l b r i c h K D e g r a d a t i o n b e h a v i o r o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l d i b l o c k a n d m u l t i b l o c k p o l y m e r s w i t h h y d r o l y t i c a l l y d e g r a d a b l e e s t e r l i n k a g e s J C o l l e c t i o n o f C z e c h o s l o v a k C h e m i c a l C o m m u n i c a t i o n s 2 0 0 4 6 9 8 1 6 4 3 1 6 5 6 1 2 J o S P a r k K S u r f a c e M o d i f i c a t i o n u s i n g s i l a n a t e d p o l y e t h y l e n e g l y c o l s J B i o m a t e r i a l s 2 0 0 0 2 1 6 6 0 5 6 1 6 1 3 T s u n o d a S I s h i k a w a T Y a m a m o t o Y e t a l E n h a n c e d a n t i t u m o r p o t e n c y o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l y a t e d t u m o r n e c r o s i s f a c t o r A n o v e l p o l y m e r c o n j u g a t i o n t e c h n i q u e w i t h a r e v e r s i b l e a m i m o p r o t e c t i v e r e a g e n t J J P h a r m a c o l E x p T h e r 1 9 9 9 2 0 9 3 6 8 3 7 2 Th e p r o t e i d e PEG p o l i s h e s G u a n g l i n L i u T h e f i r s t m i d d l e s c h o o l o f B a i C h e n g C i t y J i l i n p r o v i n c e B a i C h e n g C i t y 1 3 7 0 0 0 Ab s t r a c t T h e p r o t e i d e c h e m i s t r y h a s p o l i s h e d e f f e c t i v e a s t h e p h y s i c a l c h e m i s t r y a n d B i o l o g y c h a r a c t e r i s t i c p r o p e r t y i m p r o v i n g p r o t e i d e m e a n s h a s a l r e a d y g o t m o r e a n d m o r e m a n y r e s e a r c h a n d d e v e l o p T h e m a i n b o d y o f a b o o k h a v e s k e t c h e d t h e d e c o

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