植物转基因沉默的机制及克服方法.docx

植物转基因沉默的机制及克服方法专业：植物学 学号：220100905010 姓名：潘婷摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。1 转基因沉默机制转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制111 甲基化作用 从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。112 位置效应 转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。113 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。12 转录后水平基因沉默(PTGS)机制121 RNA阈值模型 1994年Dougherty等 提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。122 异常RNA模型 鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。123 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同，会导致正义RNA和反义RNA的合成。这些转录产物将形成dsRNA。核糖核酸酶(RNase)III家族中具有特异识别双链RNA的dicer酶，在ATP存在下，逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的dsRNA，并将RNA降解为1923 bp的双链小分子干扰RNA(siRNA)。siRNA双链结构解旋并与蛋白质形成蛋白-RNA诱导沉默复合物(RISC)。RISC在一个ATP的作用下被激活，激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上，并在距离siRNA 3端12个碱基的位置切割mRNA，进而使转基因不能表达。124 未成熟翻译终止模型 朱祯等提出了未成熟翻译终止模型。该模型指出，由于任何一类生物细胞都对密码子剂量有一定偏爱性，即密码子使用频率与细胞内相应tRNA丰度是相对匹配的。个别基因在细胞内的优势表达将造成稀有tRNA的严重缺失，相应氨酰tRNA的缺失将造成翻译复合体中核糖体的空载，当空载时间过长将会引起相应mRNA的降解，从而造成相应基因的沉默。降解mRNA片段依然与核糖体相连，此时核糖体A位处于空置状态，并随时准备接受稀有氨酰tRNA，使细胞内稀有氨酰tRNA维持在一个非常低的水平(共抑制状态)。此模型可以合理地解释RNA特异降解和与共抑制相关的其他现象。至今为止，没有一种通用的模型可以解释所有的转基因沉默现象，但各个模型往往突出解释了转基因机制中的某些方面。2 转基因沉默的克服方法21 去甲基化5-氮胞嘧啶及类似物具有很好的抑制转基因甲基化和去甲基化作用，从而抑制转基因沉默。但是5-氮胞嘧啶价格昂贵且具有致癌性，并且用它处理过的植株普遍出现矮化和结实率低等现象，故而使用范围受到限制。22 控制外源基因的拷贝数及结合位点Allen等证明在外源基因不超过40拷贝的情况下，可以减少同源依赖性基因失活，故工作中可选择留用外源基因插入基因组拷贝数低的，最好是单拷贝的转基因植株。利用定点插入的方法，将外源基因插入到与其相似的染色体区域，避免转基因随机整合到宿主基因异染色质区或转录不活跃区。如利用噬菌体P1 Cre-lox位点特异性重组系统，Albert等将外源基因整合到烟草基因组中预先存在的lox位点上。23 利用MAR序列MAR序列可以减少外源基因插入位点附近寄主染色体对外源基因表达活性的影响，还可以减少同源依赖性的基因失活。把MAR构建到外源基因两侧，形成MAR-基因-MAR形式，整合到真核细胞基因组后，会使转基因产生独立的松弛结构域，有利于RNA聚合酶等反式作用因子和DNA结合,使外源基因被活跃地表达。Kim等用MAR构建载体，转染CHO细胞，发现球蛋白基因表达量比对照提高了7倍。24 选择使用增强子具有组织与发育特异性调控作用的增强子常被用来提高外源基因的表达效果。现已知动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段去甲基化，从而启动基因转录。25 合理使用强启动子在转录水平上，外源基因启动子强弱是影响外源基因表达的一个关键因素，科研中大多使用组成型强启动子。姚斌等将2个35S启动子串联至昆虫特异性神经毒素AaIT基因并导人烟草，获得了高抗虫性的转基因烟草。有关使用诱导型启动子的转基因表达，仅在少数植物中获得了转基因植株。如转基因水稻植株中已获得了ABA胁迫诱导的uidA基因表达，已经构建了2个用于在转基因水稻中稳定表达uidA基因质粒的载体。参考文献：1Dougherty W G，Parks T DTransgenes and gene suppression：telling US something new JCurt Opin Cell Biol，1995，7：399-4052English JJ，Mueller E，Baulcombe D CSuppression of virlls accumulation in transgenic plants exhibiting silencing ofnuclear geneJPlant Cell，1996，8：1791883Waterhouse PM，Graham M WVirus resistance and gene silencing in plants can be induced by simuhaneous expression of sense and antisense RNA JProc Natl Acad Sci(USA)，1998，95祯，冯德江，刘翔. 一种获得高抗病毒转基因植物的新方法：中国，031007082P2003-01-215Kim J M，Kim J S，Park D H，et