（微生物学专业论文）扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变.pdf

福建师范大学刘燕雅硕七学位论文 h r 2 的酶活为4 9 8 u m l t m 值为3 9 3 0 c 比野生型脂肪酶p e l 的提高了0 6 0 c 测序结果表明 h r 2 突变体脂肪酶基因第2 4 6 位的a 突变为g 即脂肪酶的第8 2 位的l y s a a g 突变为a r g a g g 同时还产生了一个同义突变 第7 9 0 位的t 突变 为c 即编码a l a 的基因由g c t 突变为g c c h r 3 的酶活为5 5 2 u m l t m 值为4 2 1 0 c 比野生型脂肪酶p e l 的提高了3 4 0 c 测序结果表明 h r 3 突变体脂肪酶基因第2 0 4 位的t 突变为c 即脂肪酶的第6 8 位的l e u c t c 突变为p r o c c c 第4 2 6 位的a 突变为g 即脂肪酶的第1 4 2 位的 l y s a a g 突变为a r g a g o 综上 本研究通过定点突变共构建了1 5 个脂肪酶突变体 获得了两株较好的突 变体 o p e l e p 8 p 1 9 7 e 的热稳定性在随机突变体p e l e p 8 的基础上 迸一步提高 了2 2 0 c 比野生型p e l 提高了2 8 0 c 酶活为5 9 2 u m l p e l e p 8 p 1 0 2 l 的热稳 定性在随机突变体p e l e p 8 的基础上 进一步提高了2 6 0 c 比野生型p e l 提高了 3 6 0 c 最适作用温度降低5 0 c 酶活为6 1 2 u m l 此外 本研究还通过随机突变 获得一株较好的突变体 h r 3 热稳定性比野生型提高了3 4 0 c 酶活为5 5 2 u m l 关键词 扩展青霉脂肪酶 定点突变 随机突变 易错p c r h a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt oi m p r o v et h ee n z y m ep r o p e r t i e so ft h ep e n i c i l l u me x p a a s u ml i p a s e p e l t h ep e l g e n ew a sm u t a t e db ys i t e m u t a g e n e s i sa n dr a n d o mm u t a g e n e s i s 1 s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fp e l i no r d e rt o i m p r o v et h et h e r m o s t a b i l i t yo fp e n i c i l l i u me x p a n s u ml i p a s e p e l e l e v e nm u t a t i o n sw e r ec r e a t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s m u t a t i o n sw e r eg e n e r a t e db y o v e r l a pe x t e n s i o np c ru s i n gt h ee d n ao fw i l d t y p el i p a s eg e n e 1 i p 0 7 o ras i n g l es i t e m u t a n tl i p a s ee p 8a st h et e m p l a t ea n dt w os p e c i a lp r i m e r st h a tc o r r e s p o n d i n gt om u t a t i o n s r e c o m b i n a n tv e c t o rw h i c hc o n t a i nm u t a n tg e n e sw a sc o n s t r u c t e da n de l e c t r o p o r a t e di n t o p i c h i ap a s t e r i sg s115 1 p e l p19 7 es i n g l em u t a n ta n dp e l e p 8 p 19 7 ed o u b l em u t a n t d o u b l em u t a n tp e l e p 8 p19 7 ew a sc r e a t e db ym u t a t ep r ot og l ua t19 7b a s e do n t h e s i n g l e m u t a n tp e l e p 8 t h ed o u b l em u t a n ts h o w sag o o d i m p r o v e m e n ti n t h e r m o s t a b i l i t yw i t hat mo f4 1 5 0 c w h i c hi s2 8 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a n d 2 2 0 ch i g h e rt h a ns i n g l em u t a n tp e l e p 8 p e l p19 7 ei sas i n g l em u t a n to fp e la ta m i n oa c i d19 7 t h et mo ft h i sm u t a n ti s 3 9 5 0 cw h i c hi s0 9 0 ch i g h e rt h ep e l a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n t a n dd o u b l em u t a n ta r e5 5 6 u m la n d5 9 2 u m l r e s p e c t l y i na d d i t i o n t h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yo f p e l e p 8 一p 19 7 ei sc h a n g e d 2 p e l k 15 2 rs i n g l em u t a n ta n dp e l e p 8 一k 1 5 2 rd o u b l em u t a n t d o u b l em u t a n tp e l e p 8 k 15 2 rw a sc r e a t e db ym u t a t el y st oa r ga t15 2b a s e do n t h es i g n a lm u t a n tp e l e p 8 t h et mo ft h i sm u t a n ti s3 8 9 0 cw h i c hi ss i m i l a rt ot h a to ft h e w i l d t y p ee n z y m e p e l k 15 2 ri sas i n g l em u t a n to fp e la ta m i n oa c i d15 2 t h et mo ft h i sm u t a n ti s 3 8 9 0 cw h i c hi ss i m i l a rt ot h a to f t h e w i l d t y p ee n z y m e a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n t a n dd o u b l em u t a n ta r e5 3 0 u m la n d4 1 6 u m lr e s p e c t l y 3 p e l p 10 2 l s i n g l em u t a n ta n dp e l e p 8 一p 10 2 ld o u b l em u t a n t i i i 福建师范大学刘燕雅硕士学位论文 d o u b l em u t a n tp e l e p 8 一p10 2 lw a sc r e a t e db ym u t a t ep r ot ol e ua tl0 2b a s e do n t h es i n g l em u t a n tp e l e p 8 t h ed o u b l em u t a n ts h o w sag o o di m p r o v e m e n ti n t h e r m o s t a b i l i t yw i t hat mo f4 0 9 0 c w h i c hi s3 6 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a n d 2 6 ch i g h e rt h a ns i n g l em u t a n tp e l e p 8 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e l e p 8 p 10 2 l i s4 5 0 c 5 0 ch i g h e rt h a nt h a to ft h ew i l d t y p ee n z y m e p e l p10 2 li sas i n g l em u t a n to fp e la ta m i n oa c i d10 2 a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n t a n dd o u b l em u t a n ta r e3 0 0 u m la n d612 u m lr e s p e c t l y 4 p e l n 16 6 d s i n g l em u t a n ta n dp e l e p 8 n 16 6 dd o u b l em u t a n t d o u b l em u t a n tp e l e p 8 n16 6 dw a sc r e a t e db ym u t a t ea s nt oa s pa t16 6b a s e do n t h es i n g l em u t a n tp e l e p 8 t h ed o u b l em u t a n ts h o w sr e d u c e di nt h e r m o s t a b i l i t yw i t ha t mo f3 6 2 0 c w h i c hi s1 1o cl o w e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a n d2 1o cl o w e rt h a ns i n g l e m u t a n tp e l e p 8 p e l n16 6 di sas i n g l em u t a n to fp e la ta m i n oa c i d16 6 a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs i n g l em u t a n t a n dd o u b l em u t a n tf i r e2 36 u m la n d2 5 2 u m lr e s p e c t l y 5 p e l e p 8 p 1 6 3 ad o u b l em u t a n t d o u b l em u t a n tp e l e p 8 p16 3 aw a sc r e a t e db ym u t a t ep r ot oa l aa t16 3b a s e do n t h e s i n g l e m u t a n tp e l e p 8 t h ed o u b l em u t a n ts h o w sag o o d i m p r o v e m e n ti n t h e r m o s t a b i l i t yw i t hat mo f3 8 3 c w h i c hi s 1 0 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e la n d t h es a m et os i n g l em u t a n tp e l e p 8 6 p e l e p 8 一k 1 2 0 r p e l e p 8 一m 1 9 3 vd o u b l em u t a n t d o u b l em u t a n tp e l e p 8 k 1 2 0 rw a sc r e a t e db ym u t a t el y st oa r ga t1 2 0b a s e do n t h es i g n a lm u t a n tp e l e p 8 t h ed o u b l em u t a n ts h o w sr e d u c e di nt h e r m o s t a b i l i t yw i t ha t mo f3 5 8 0 c w h i c hi s1 5 0 cl o w e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a n d2 5 cl o w e rt h a ns i n g l e m u t a n tp e l e p 8 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e l e p 8 k 12 0 ri s3 5 0 c 5 0 cl o w e rt h a n t h a to ft h ew i l d t y p ee n z y m e t h ee n z y m a t i c a c t i v i t y o fb o t hp e l e p 8 k 12 0 ra n dp e l e p 8 一m 19 3 vw e r e d e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y 7 p e l g 2 0 5 a p e l k 9 4 d p e l k 9 4 r p e l w 16 9 ns i n g l em u t a n t i v a b s t r a c t a l lo ft h ef o u r s i n g l em u t a t i o n s p e l g 2 0 5 a p e l k 9 4 d p e l k 9 4 r a n d p e l w 16 9 nd i dn o ts h o wl i p a s ea c t i v i t yw h e nm e yw e l et e s t e do na no l i v eo i la g a rp l a t e a n da c t i v i t ym e a s u r e 2 r a n d o mm u t a g e n e s i so fp e l b ye r r o r p r o n ep c r t h ep e lg e n ew a sm u t a t e db yr a n d o mm u t a g e n e s i su s i n ge r r o r p r o n ep c r 3 2 p o s i t i v ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e df r o ma m o n ga b o u t8 0 0 0t r a n s f o r m a n t sb ya g a rp l a t ea n d t w ot h e r m o s t a b l em u t a t i o n sw e r eo b t a i n e df r o m3 2p o s i t i v ec l o n e sb yas e c o n ds e l e c t i o n h r 2s h o w sag o o di m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t yw i t h3 9 3 c w h i c hi s0 6 0 c h i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m e a c t i v i t yo fh r 2i s4 9 8 u m l o n l yo n ea m i n oa c i d s u b s t i t u t i o no fl y s 8 2 a r gw a s i d e n t i f i e db yd n a s e q u e n c i n g h r 3s h o w sag o o di m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t yw i t h4 2 1 c w h i c hi s3 4 0 c h i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l a f t e rt h r e ed a y sm e t h a n o li n d u c e de x p r e s s i o n t h ee n z y m e a c t i v i t yo fh r 3i s5 5 2 u m l t h ed n as e q u e n c i n gr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e r ea r et w o s u b s t i t u t i o n s l e u 6 8 p r oa n dl y s 14 2 a r g i ns y n t h e s i s 15m u t a n tw e r ec o n s t r u c t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s a n dt w og o o d m u t a n tw e r eo b t a i n e d o p e l e p 8 p19 7 es h o w sag o o di m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t y w i mat mo f 4 1 5 0 c w h i c hi s2 8 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e la n d2 2 0 ch i g h e rt h a n s i n g l em u t a n tp e l e p 8 室 p e l e p 8 一p 10 2 ls h o w sa g o o di m p r o v e m e n t i nt h e r r n o s t a b i l i t y w i t hat mo f 4 0 9 0 c w h i c hi s3 6 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e la n d2 6 0 ch i g h e rt h a n s i n g l em u t a n tp e l e p 8 i na d d i t i o n o n et h e r m o s t a b l em u t a n t h r 3 w a so b t m n e db y e r r o r p r o n ep c r h r 3s h o w sag o o d i m p r o v e m e n ti nt h e r m o s t a b i l i t yw i t h4 2 1o c w h i c h i s3 4 0 ch i g h e rt h a nt h ew i l d t y p ep e l t h ee n z y m ea c t i v i t yo f h r 3i s5 5 2 u m l k e y w o r d p e n i c i l l u me x p a a s u ml i p a s e s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s r a n d o mm u t a g e n e s i s e r r o r p r o n ep c r v 福建师范大学刘燕雅硕士学位论文 l l i l l 一一 l v i 1 jl 中文文摘 中文文摘 脂肪酶 1 i p a s ee c 3 1 1 3 是一类能催化长链甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸或 此反应的逆反应的酶类 除了具有高催化效率 专一性 无污染性等生物酶的一般 特性外 一个突出的特点是在异相体系中具有催化活性 即在油水界面能够催化酯 水解或醇解 氨解 酯合成 酯交换 内酯合成 高聚物合成以及手性药物的拆分 等反应 脂肪酶的多种催化能力使其成为一种重要的工业用酶 被广泛应用于油脂水解 食品风味改进 洗涤剂 废纸脱墨 生物柴油催化 工业造纸等行业 每种应用都 要求脂肪酶具有相应的特性 即底物的特异性 温度范围 p h 值范围 对热 各种 化学氧化剂及变性因子的稳定性等都有各自不同的要求 但是由于天然脂肪酶对环 境变化的耐受力低 稳定性较差 易被蛋白酶降解 与一些表面活性剂不相容等缺 点 很大程度上限制了它在工业生产中的应用 因此 利用蛋白质工程对脂肪酶进 行分子改造 以期获得酶学性质达到各种工业要求的新型脂肪酶 本研究旨在利用蛋白质工程对p e l 进行分子改造 以期获得稳定性提高或最适 作用温度改变的突变体 进行了以下两方面的工作 1 选择了p 1 9 7 e k 1 5 2 r p 1 0 2 l n 1 6 6 d p 1 6 3 a k 9 4 d k 9 4 r k 1 2 0 r w 1 6 9 n m 1 9 3 v 十个点进行了单点突变及叠加突变 2 采用易错p c r 的方法对p e l 进行随机突变 筛选表达水平更高或稳定性提 高的重组子 1p e l 的定点突变 1 p 1 9 7 e 的单点突变及叠加突变 p r 0 1 9 7 位于脂肪酶分子表面的无规卷曲处 远离酶的活性中心 s e r l 3 2 a s p l 8 8 h i s 2 4 1 且酸性氨基酸以及蛋白表面带电荷的氨基酸对蛋白的热稳 定性有一定的贡献 因此用带负电荷的酸性的谷氨酸替换脯氨酸 可能改善脂肪酶 的亲水性 增加酶分子的包装效率 从而提高酶的热稳定性 实验结果表明 p e l p 1 9 7 e 发酵酶活为5 5 6u m l 比野生型提高了1 7 4 热 稳定性t m 值为3 9 5 0 c 比野生型提高了0 9 0 c 叠加突变体p e l e p 8 一p 1 9 7 e 的酶活 为5 9 2u m l 比野生型p e l 脂肪酶提高了2 9 8 而比随机突变体p e l e p 8 脂肪酶 的降低了9 1 其t m 为4 1 5 0 c 比野生型脂肪酶p e l 的提高2 8 0 c 比随机突变 v u 1 福建师范大学刘燕雅硕士学位论文 体p e l e p 8 的提高2 2 0 c 体现了两点叠加的效应 此外 叠加突变体p e l e p 8 p 1 9 7 e 的底物特异性发生了改变 2 k 1 5 2 r 的单点突变及叠加突变 l y s1 5 2 位于靠近酶活性中心的无规卷曲上 在较高的温度下 a r g 比l y s 更能 维持蛋白质的盐桥 因此用侧链含有一个胍基的同样带正电荷的a r g 代替l y s 可 能形成新的氢键 盐桥 离子相互作用 从而提高酶分子的热稳定性 实验结果表明 单点突变p e l k 15 2 r 的酶活为5 3 0 u m l 比野生型的提高了 1 1 8 t m 值为3 8 9 0 c 与野生型相仿 叠加突变体p e l e p 8 k 1 5 2 r 的酶活为 4 1 6 u m l 比野生型的降低了9 8 比随机突变体p e l e p 8 的降低了3 5 4 其热 稳定性与单点突变一样 3 p 1 0 2 l 的单点突变及叠加突变 p r 0 1 0 2 位于远离活性中心的1 2 螺旋上 而脯氨酸不利于c 螺旋的稳定性 以侧链 同样含有四个碳原子且结构相对较紧凑的l e u 取代 稳定0 螺旋的同时也增加了氢键 的数目 均有利于酶热稳定性的提高 实验结果表明 单点突变体p e l p 1 0 2 l 的最适作用温度与野生型的一致 酶活为 3 0 0 u m l 比野生型p e l 降低了3 6 7 叠加突变体p e l e p 8 一p 1 0 2 l 的最适作用温度 为4 5 0 c 比野生型p e l 和随机突变体p e l e p 8 都提高了5 0 c 酶活为6 1 2u m l 比野 生型p e l 提高了2 9 1 比随机突变体p e l e p 8 降t k 毛t 9 8 其t m 为4 0 9 0 c 比野生 型p e l 提高了3 6 0 c 比随机突变体提高了2 6 0 c 4 n 1 6 6 d 的单点突变及叠加突变 a s n l 6 6 位于远离活性中心的0 螺旋n 端 在此引入带有负电荷侧链的a s p 既 可以稳定c 螺旋 又增加的一个盐桥 有利于酶热稳定性的提高 实验结果表明 单点突变体p e l n 1 6 6 d 叠加突变体p e l e p 8 n 1 6 6 d 的酶活分 别为2 3 6u m l 2 5 2 u m l 酶活均表现出较大程度的下降 p e l e p 8 n 1 6 6 d 的t m 为3 6 2 0 c 比野生型p e l 下降了1 1 0 c 比随机突变体下降了2 1 0 c 5 p 1 6 3 a 的叠加突变 由于脯氨酸数目的减少可增加酶分子的柔顺性 使酶在较低的温度下可以更好 的发挥活性 从而降低酶的最适作用温度 p r 0 1 6 3 位于无规卷曲上 因此以柔顺性 较强的a l a 代替 实验结果表明 叠加突变体p e l e p 8 p 1 6 3 a 的最适作用温度并没有发生改变 其 v i i i i 中文文摘 酶活为4 4 4 u m l 比野生型p e l i n 肪酶的降低了6 3 比随机突变体p e l e p 8 j 旨肪酶 的降低了3 3 8 t m 为3 8 3 c 比野生型p e l 的提高了1 0 0 c 而与随机突变体e p 8 的 t m 一致 6 k 1 2 0 r m 1 9 3 v 的叠加突变 l y s l 2 0 位于酶分子表面的 螺旋上 在较高的温度下 a r g l 匕l y s 更能维持蛋白质 的盐桥 因此用侧链含有一个胍基的同样带正电荷的a r g 代替l y s 可能形成新的氢 键 盐桥 离子相互作用 从而提高酶分子的热稳定性 实验结果表明 叠加突变体p e l e p 8 k 1 2 0 r 的最适作用温度为3 5 0 c 比野生型 p e l 和随机突变体p e l e p 8 降低了5 0 c 酶活降低较明显 为2 4 4 u m l 热稳定性也 有所降低 比野生型p e l 降低了1 5 0 c 比随机突变体p e l e p 8 降低了2 5 0 c m e t l 9 3 位于内部无规卷曲上 把m e t 转换为v a l 有可能增加酶的稳定性 实验结 果表明 叠加突变体p e l e p 8 m 1 9 3 v 的发酵酶活所剩无几 仅为4 0u m l 7 g 2 0 5 a k 9 4 d k 9 4 r w 1 6 9 n 的单点突变 单点突变体p e l k 9 4 d p e l k 9 4 r p e l g 2 0 5 a 和p e l w 1 6 9 n 均检测不到其发 酵酶活 t r p l 6 9 位于远离酶活性中心的0 螺旋上 将其突变为a s n 更有利于0 螺旋的稳 定 从而提高蛋白质的稳定性 g 1 y 2 0 5 l y s9 4 均位于d 折叠上 d 层可能由于其残 基间的相互关系更加密切而不适合做定点突变 2p e l 的随机突变 易错p c r 是相对简便 快捷也是使用较广泛的构建突变体库的方法 使用该法 改造酶分子的成功例子有很多 见绪论 本研究通过易错p c r 的方法对扩展青霉脂 肪酶进行随机突变 构建含有突变基因的重组质粒 电转化至毕赤酵母g s l l 5 再 进行y p o m 平板初筛以及摇瓶的复筛 最终获得两株热稳定性有所提高的突变体 h r 2 h r 3 h r 2 的发酵酶活为4 9 8 u m l 为野生型p e l 脂肪酶的1 0 5 1 其t m 值为3 9 3 0 c 比野生型脂肪酶p e l 的提高了0 6 0 c 测序结果表明 h r 2 突变体脂肪酶基因第2 4 6 位的a 突变为g 即脂肪酶的第8 2 位的l y s a a g 突变为a r g a g g 同时还产生 了一个同义突变 第7 9 0 位的t 突变为c 即编码a l a 的基因由g c t 突变为g c c h r 3 的酶活为5 5 2 u m l 为野生型p e l 脂肪酶的1 1 6 5 其t m 值为4 2 1 0 c 比野生型脂肪酶p e l 的提高了3 4 0 c 测序结果表明 h r 3 突变体脂肪酶基因第2 0 4 位的t 突变为c 即脂肪酶的第6 8 位的l e u c t c 突变为p r o c c c 第4 2 6 位的a i x 福建师范大学刘燕雅硕士学位论文 突变为g 即脂肪酶的第1 4 2 位的l y s a a g 突变为a r g a g g 总之 作者对扩展青霉脂肪酶进行了定点突变和随机突变 通过定点突变构 建了1 5 个脂肪酶突变体 获得了两株较好的突变体 p e l e p 8 p 1 9 7 e 的热稳定性在 随机突变体p e l e p 8 的基础上 进一步提高了2 2 0 c 比野生型p e l 提高了2 8 0 c 酶活为5 9 2 u m l p e l e p 8 p 1 0 2 l 的热稳定性在随机突变体p e l e p 8 的基础上 进 一步提高了2 6 0 c 比野生型p e l 提高了3 6 0 c 最适作用温度降低了5 0 c 酶活 为6 1 2 u m l 通过随机突变获得两株突变体th r 2 热稳定性比野生型提高了0 6 0 c 酶活为4 9 8 u m l h r 3 热稳定性比野生型提高了3 4 0 c 酶活为5 5 2 u m l x 目录 目录 摘要 i a b s t r a c t 中文文摘 v i i 目录 x i 第一章绪论 1 1 理性设计 2 2 非理性设计 2 1 突变体库的构建策略 4 2 2 1 基于p c r 而实现的随机突变 4 2 2 2 基于同源重组而实现的随机突变 7 2 2 3 基于非同源重组而实现的随机突变 1 5 2 3 定向进化筛选策略 1 7 2 3 1 表型观察选择和筛选 1 7 2 3 2 微孔板滴定法 1 8 2 3 3 各种展示技术 1 9 3 半理性设计 2 2 第二章材料与方法 2 3 1 实验材料 2 3 1 1 菌种和质粒 2 3 1 2 酶与试剂 2 3 1 3 常用培养基及缓冲液 2 3 1 4 寡核苷酸引物 2 5 1 5 常用仪器 2 6 2 实验方法 2 6 2 1 扩展青霉脂肪酶的定点突变 2 6 2 1 1p 1 9 7 e k 1 5 2 r p 1 0 2 l n 1 6 6 d 的单点突变及叠加突变 2 6 2 1 2p 1 6 3 a m 1 9 3 v k 1 2 0 r 的叠加突变 3 2 2 1 3g 2 0 5 a k 9 4 r w 1 6 9 n k 9 4 d 的单点突变 3 4 x i f 福建师范大学刘燕雅硕士学位论文 2 2 扩展青霉脂肪酶的随机突变 3 5 2 2 1 突变体库的获得 3 5 2 2 2 随机突变基因表达载体的构建及表达1 1 1 4 列 3 6 2 2 3 酶学性质的测定 3 6 2 2 4 突变体脂肪酶基因的序列测定 3 7 第三章结果与分析 3 9 1 p e l 的定点突变 3 9 1 1 突变点的选择 3 9 1 2p 1 9 7 e 的单点突变及叠加突变 4 0 1 3k 1 5 2 r 的单点突变及叠加突变 4 6 1 4p 1 0 2 l 的单点突变及叠加突变 5 2 1 5n 1 6 6 d 的单点突变及叠加突变 5 5 1 6p 1 6 3 a 的叠加突变 5 9 1 7k 1 2 0 r m 1 9 3 v 的叠加突变 6 1 1 8g 2 0 5 a k 9 4 r k 9 4 d w 1 6 9 n 的单点突变 6 4 2p e l 的随机突变 6 6 2 1 随机突变基因的获得 6 6 2 2 表达质粒库的构建及在毕赤酵母中的表达 6 7 2 3 突变体的酶学性质 6 8 2 4 突变体核苷酸序列测定 7 0 第四章小结与讨论 7 1 1p e l 的定点突变 7 1 2p e l 的l 疆机突变 7 4 1 砉论 7 7 1 定点突变 7 7 2 随机突变 7 8 参考文献 8 1 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 9 5 致谢 9 7 个人简历 9 9 x i i 第一章绪论 第一章绪论 酶的分子改造 w i n t e r 等于1 9 8 2 年首次报道了通过基因定点突变获得改性酪氨酸t r n a 合成酶 q o1 9 8 3 年u l m e r 在 s c i e n c e 上发表以 p r o t e i ne n g i n e e r i n g 蛋白质工程 为题的专 论 2 1 标志着蛋白质工程这一新兴生物技术领域的诞生 它的出现巨大的推动了分 子生物学有关前沿的研究 受到了学术界和产业界的广泛重视 其主要内容和目的 可概括为 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础 通过有控制的 基因修饰和基因合成 对现有蛋白质加以定向改造 设计 构建并最终生产出性能 比自然界存在的蛋白质更加优良 更加符合人类社会需要的新型蛋白质 3 1 9 9 3 年 美国的科学家a r n o l dfh 首次提出酶分子定向进化的概念 当时仅是 通过调整p c r 体系的方法作为易错的条件以达到随机突变的效果 并成功应用于枯 草杆菌蛋白酶e 的改造 其突变体p c 3 在高浓度有机溶剂中 6 0 二甲基甲酰胺 的 催化活性为野生型的2 5 6 倍 4 随后e r r o r p r o n ep c r 便广泛用于酶分子的改性 如 n i s h i y a 等通过e r r o r p r o n ep c r 改变肌氨酸氧化酶的底物特异性及最适p h 值 5 r e l l o s 等利用e r r o r p r o n ep c r 获得的乙醇脱氢酶突变体t s 1 的热稳定性提高了3 0 c o k a d a 等也用随机突变的方法将p 淀粉酶的热稳定性提高了2 3 0 c 6 定向进化的思想随着易错p c r 技术的广泛应用及取得的成功经验也在不断的成 熟和发展 1 9 9 4 年 美国科学家s t e m m e r 在n a t u r e 上发表了一篇题为 r a p i de v o l u t i o n o fa p r o t e i ni nv i t r ob yd n as h u f f l i n g 首次提出7d n as h u f f l i n g 技术 p 内酰胺酶是一 种水解头孢类抗生素的微生物酶类 s t e m m e r 哪 内酰胺酶系统为试验对象 用 d n a s ei 消化其基因 通过三轮重组 s h u f f l i n g 和两轮回交 b a c k c r o s s i n g 最终获得了 对头孢类抗生素抗性增强3 2 0 0 0 倍的d 内酰胺酶 7 1 这一技术是定向进化发展过程中 的一次重大飞跃 它包括了d n a 重新组装的过程 与以往的突变技术 如定点突变 易错p c r 相比有了质的改变 不仅可以加快正向突变的有效积累 同时排除突变过 程中产生的绝大部分的中性突变及有害突变 而且可以综合酶的两个甚至多个优良 性状 引 基于d n a 同源重组的原理 近年来又产生一系列新方法 如交错延伸p c r 技术 s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s s t e p 9 1 随机引物体外重组法 r a n d o m p r i m i n gi nv i t r o 福建师范大学刘燕雅硕十学位论文 r e c o m b i n e a t i o n r p r o o 过渡模板随机嵌合生长技术 r a n d o m c h i m e r a g e n e s i so n t r a n s i e n tt e m p l a t e r a c h i t tt 1 1 外显子洗牌 e x o ns h u f f l i n g b 2 将体外d n a 重组与 酵母体内重排相结合的酵母增强组合文库 c o m b i n a t o r i a ll i b r a r i e se n h a n c e db y r e c o m b i n a t i o ni n y e a s t l c e r y 1 1 3 1 等等 以及基于d n a 非同源重组产生的新方法 如渐进式切割产生杂合酶 i n c r e m e n t a lt r u n c a t i o nf o rt h ec r e a t i o no fh y b r i de n z y m e s i t c h y 1 4 16 1 不依赖序列同源性的重组 s e q u e n c eh o m o l o g y i n d e p e n d e n tp r o t e i n r e c o m b i n a t i o n s h i p r e c 1 7 1 i t c h y 与d n as h u f f l i n g 相结合的s c r a t c h y 1 引 以 结构为基础的重组蛋白工程 s t r u c t u r e b a s e dc o m b i n a t o r i a lp r o t e i ne n g i n e e r i n g s c o p e t 1 9 2 0 1 不依赖序列的定点装配 s e q u e n c e i n d e p e n d e n ts i t e d i r e c t e d c h i m e r a g e n e s i s s i s d c 2 1 等等 1 理性设计 定点突变 s i t ed i r e c t e dm u t a g e n e s i s 是理性设计的主要代表方法之一 它可以任 意的在已知d n a 序列中替换 增添或缺失特定的核苷酸 从而改变蛋白质结构中 的氨基酸 该方法与传统的化学物理诱变法导致的突变相比 具有突变率高 简单 易行 重复性好等优点 理性设计被国内外的学者广泛应用于各种酶分子的改造 仅以 s i t ed i r e c t e d m u t a g e n e s i s 为关键词在 p u d m e d 里搜索就可以查到2 9 6 7 篇文献 但是这种方法要 求结合生物化学 晶体学 光谱学 计算机模拟等对酶进行研究 获得所研究酶的 高级结构 即酶x r a y 衍射晶体结构 或者应用分子模拟技术 将空间结构未知的酶 与同源性较高的已知结构的酶进行比对 预测并构建该酶三维结构模拟 结合基因 定点突变等方法在蛋白质引入二硫键 增加内氢键数目 增加表面盐桥 改善内疏 水堆积等来改善酶学特性 利用定点突变改进酶特性的成功例子有很多 如a k e os h i n k a i 等人所构建的 n 1 6 3 s l 2 6 4 p 绿脓假单胞菌脂肪酶突变体的热稳定性分别提高了1 5 0 c 3 0 0 c 2 2 s p a t k a r 等在c a l b c a n d i d aa n t a r c t i c abl i p a s e 的保守序列中引入t 1 0 3 g 突变点后 使其t d 值提高了4 c 2 3 1 k u l a k o v al 等人在酯酶p s y e s t p s y c h r o b a c t e rs p a n t 3 0 0 e s t e r a s e 中引入突变点g 2 4 4 p 使其半衰期由原来的1 6m i n 延长至1 1 6h 2 4 k a u f f m a n n 等利用定点突变构建了含l 3 5 3 s 突变点的b t h e r m o c a t e n u l a t u s 脂肪酶 第一章绪论 使其磷脂水解活性提高了5 倍 2 5 1 b r a n n e b y 等在ca n t a r c t i c a 脂肪酶b 基因中引 入s 1 0 5 a 突变点后 使其产生了新活性 醛缩反应活性陶 杨萌浩等构建的 n 1 3 d s 4 0 e 木聚糖酶x y n b 突变体的热稳定性在7 0 0 c 处理5r a i n 后分别提高了 2 4 7 6 和1 4 4 6 t 2 7 l e e 等在cr u g o s a 脂肪酶d n a 序列中引入了a 2 9 6 i v 3 4 4 q v 3 4 4 h 使突变体的底物特异性发生了改变 2 8 b a k k e 等构建的f 4 2 c