第十章 RNA的生物合成.docx

第十章 RNA的生物合成(转录)教学目标：1.掌握转录的概念和转录体系的组成。2.熟悉原核生物转录的基本过程。比较真核生物的转录与原核生物不同。3.了解RNA转录后加工的方式（内含子、外显子、核酶的概念）。4.了解RNA复制的概念。导入：从生物化学意义上说，基因(gene)是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物是各种RNA和蛋白质。基因表达包括细胞的遗传信息从DNA到RNA，再由RNA到蛋白质。前者称为转录，后者称为翻译。第一节 转录一、转录的概念和特点转录（transcription）是DNA指导下的RNA合成过程，即DNA模扳的碱基序转抄成RNA的碱基序列。转录和复制有许多相似之处：都是酶促的核苷酸聚合过程；都以DNA为模板；都需依赖DNA的聚合酶；都按模板链的碱基配对原则和5 3方向在核苷酸之间生成磷酸二酯键，且延伸新链。不同的是：1.不对称转录转录不像复制要保留细胞的全部遗传信息，而是在细胞不同的发育时序，按生存条件和生理需要，部分遗传信息（结构基因）的表达。所以转录对基因组庞大的DNA链有选择性，这种选择是不对称的（asymmetric）。即DNA分子中进行转录的某一活化基因区段称模板链（template strand），与其对应的互补链不转录，称编码链（coding strand）。对各种基因来说，模板链并非总在同一条单链上。2.RNA聚合酶（又称DNA指导的RNA聚合酶，DDRP）该酶广泛存在于原核生物和真核生物中，以4种NTP为底物，无需引物，直接在模板上合成RNA链。原核生物中所有的RNA都由一种RNA聚合酶合成。大肠杆菌RNA- pol分子量为460kDa，由5个亚基组成，分别为2、。2称为核心酶，只能使已开始合成的RNA链延长，不具有起始合成RNA的能力，因子有识别转录起始位点的作用。启动转录只有全酶与模板DNA启动子结合才发挥作用。真核生物RNA- pol有多种，分子量大致都在500kDa左右。DDRP分布在核仁，合成rRNA前体DDRP分布在核质，合成mRNA，hnRNADDRP分布在核质，合成tRNA，5SrRNA，snRNA线粒体RNA聚合酶合成线粒体RNA二、转录过程转录是包括起始延伸终止的连续过程。原核生物的转录和真核生物的转录在起始和终止上有较多的不同。（一）启动子和起始启动子（promoter）是指RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列。原核启动子发现有两个重要序列，一个位于转录起始位点上游10个核苷酸处（习惯上被转录为RNA的DNA模板上的第一个核苷酸指定为+1，即转录起始位点），另一个位于上游35个核苷酸处，它们分别称为10序列和35序列。10序列富含TATAAT，称之TATA box或Pribnow box。该序列富含AT，维持双链结合的氢键相对较弱，易发生解链，是RNA聚合酶的核心酶结合部位。35序列富含TTGACA，是RNA聚合酶亚基的识别部位。实验可知原核生物RNA聚合酶作用的区域为50+20。在转录起始阶段，RNA聚合酶识别将拷贝的基因的上游DNA（即启动子），局部解开双链（特别是TATA box处，约17个bp），当酶移至转录起始位点（+1处），催化按模板链碱基序依次排列的头两个三磷酸核苷聚合，生成RNA链的第一个3，5-磷酸二酯键，第一个核苷酸一定是三磷酸嘌呤核苷酸，而且pppG较pppA又占绝对优势，5-端的pppG这一末端结构一旦生成，一直保持到转录完成。（二）延伸转录起始后，RNA聚合酶、DNA模板以及第一个聚合生成的四磷酸二核苷酸（即5pppGpN-OH3）三者形成一个复合体，此时亚基脱落（与另一核心酶结合而重复使用），核心酶沿DNA链的35方向移动（转录方向），而RNA链按53方向延伸。由RNA聚合酶、DNA模板和新生RNA组成的区域叫做“转录泡”（transcription bubble）。新生RNA与DNA模板链暂时形成短的杂交双链（长度约为12bp），这有利于正确阅读模板链的碱基序，但A=U配对稳定性最低。在延伸阶段约有DNA的20个bp被解开，延伸速率约每秒50个核苷酸，在此时间内转录泡移动17.0nm。当RNA从DNA上脱离，暂时局部解开的双链及时复合。研究发现，在同一DNA模板上，有许多RNA聚合酶同时结合其上，同步催化转录作用，从转录起始点到终止点有一系列长短不一的新生RNA链，它们逐渐加长和不断延伸，还被排斥于DNA模板之外。（三）终止子和终止终止子（terminator）是指所转录的RNA行将结束时，模板DNA分子上出现的有终止信号的序列，它可被RNA聚合酶本身或其辅助因子所识别。E.coli有两类终止子：不依赖因子的，称简单终止子。该终止子有一特殊序列与终止有关，称回文序列（它是两段由多个GC碱基对组成的反向重复序列），随后相连AT序列，因为回文DNA上合成的RNA是自身互补的，可以形成发夹结构，该结构可使RNA聚合酶减慢移动或暂停RNA合成，导致转录终止；此外，模板DNA5-末端的AT区中含有一连串A，故在转录出的RNA链的3-终止端为一连串的U （polyU约有6个），它提供信号使RNA聚合酶脱离模板，RNA链从DNA链上解离（U-A结合最弱）。依赖因子的终止子，其回文结构不富含G-C序。因子是由6个亚基组成的一种“终止蛋白质”，有RNA-DNA解旋酶的活力。它结合在新生的RNA链上，借助水解NTP获得的能量推动其沿RNA链移动，但速度比RNA聚合酶慢，当聚合酶遇到终止子时发生暂停，因子得以赶上酶，并相互作用，导致释放RNA，并使聚合酶与它一起从DNA上脱离。（四）真核生物中的基因转录1.真核生物基因组构复杂，大部分蛋白质编码基因是不连续的，编码序列（称外显子exon）被非编码序列（内含子intron）中断。2.不同的物种、不同细胞或不同的基因可以有不同的上游DNA序列，统称为顺式作用元件（cis-acting element），DDRP识别的大部分启动子在25bp处有一个TATAbox（赫哥尼斯盒）。能直接或间接辩认、结合转录上游区段的蛋白质统称反式作用因子（trans-acting factor），直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子（transcriptional factor，TF）。3.转录起始，需要几个TF先后与启动子装配成复合物，进而协助DDRP结合形成转录起始复合物。4.DDRP不在特定的位点终止，会在基因下游不同距离处终止，和转录后加工有关。由DDRP从蛋白质编码基因上合成的RNA分子称原始转录物（或称RNA前体）。（五）转录过程的抑制剂转录过程的选择性抑制可通过与DNA结合改变模板功能或抑制RNA聚合酶的活性阻止RNA的合成。前者有放线菌素D，对原核和真核均有专一抑制作用；后者有利福平、-鹅膏蕈碱等。利福平仅阻止原核RNA的合成，-鹅膏蕈碱则是真核细胞中RNA合成的专一抑制剂，通过DDRP阻止mRNA的合成。第二节 转录后加工一、mRNA加工原核细胞合成的mRNA不需要或很少需要加工，许多mRNA甚至在合成前就开始翻译。真核细胞mRNA的前体是hnRNA（不均一核RNA），hnRNA分子量大，半衰期很短，其加工过程比较复杂，包括5- 端加帽、3- 端加尾和中段序列的剪接，一般在核内进行。1. 帽结构hnRNA合成一结束，5-端就被加上一个甲基化的鸟嘌呤帽（capO），帽子结构是5m7GpppGp。形成过程是磷酸酶将其末端磷酸基除去，和GTP作用形成55三磷酸键，接着在甲基化酶的作用下，由S-腺苷酸甲硫氨酸提供甲基加到末端的鸟嘌呤上形成capO。甲基可以加到G后面的第一个核苷酸的核糖上形成cap1或加到G后面两个核苷酸上形成cap2。该结构的功能可能对mRNA的稳定和它在翻译中起识别作用有关。2. 3端加尾帽化后的hnRNA由核酸内切酶切去3端一些过剩的核苷酸，3端切除信号在高等真核细胞是靠近3端区有一段保守序列AAUAAA，也是多聚腺苷酸化的信号，多聚腺苷酸聚合酶再以ATP为底物催化形成polyA尾（约100200个）。polyA尾的功能是保护最终的mRNA3端免受核酸酶的降解而稳定mRNA。3. RNA剪接（RNA splicing）剪接在加帽加尾后进行。由核酸内切酶把内含子和外显子连接的磷酸二酯键水解，去除内含子，把相邻外显子的末端连接生成功能性mRNA。不同的剪接途径允许由单个基因合成几种不同的蛋白质。内含子5剪切位点总是以GU开始，3剪切位点以AG结束且上游有一个含A的分支点和保守的嘧啶序。剪接反应涉及两步转酯反应并在剪接体装配后进行。分支点中腺苷酸残基的2- OH攻击5剪切位点的35磷酸二酯键，使该键断裂；内含子5回折与分支点上的A形成不寻常的25键（内含子似牛仔的套索）；外显子1的新3OH攻击3剪切位点的磷酸二酯键，使得两个外显子连接，释放套索状的内含子。两步转酯反应中，因磷酸酯键的数目没有改变，所以没有ATP的消耗。RNA剪接需要核内小核糖核蛋白（snRNP）和一些辅助蛋白质，这些蛋白质在将被去除的内含子上装配为剪接体。snRNP由snRNA与一些蛋白质结合形成，snRNA似乎是执行催化作用（催化性的RNA称为核酶）。成熟的mRNA通过核膜孔转运到细胞质，指导蛋白质的合成。二、tRNA加工原核和真核细胞tRNA的基因转录产物为tRNA前体，通过加工形成成熟的tRNA，各种tRNA的前体结构和加工方式不尽相同，一般加工过程包括：1. 核酸内切酶切断tRNA两端核酸内切酶不同于DNA限制性内切酶，它不能识别特异的序列，所识别的是加工部位的空间结构。大肠杆菌核糖核酸酶P（RNaseP）是一类切断前体5端的加工酶，切除3端的为RNaseF。真核生物tRNA前体中的内含子位于反密码子环上，由RNA剪接反应除去，不同于mRNA的剪接反应的是不涉及转酯反应。2. 核酸外切酶（RNaseD）从3端逐个切除附加序列3. 3端加CCA-OH结构，催化反应的酶是tRNA核苷酰转移酶（有些细菌tRNA不需要这种加工）。4. 修饰碱基的形成，由特异性的tRNA修饰酶作用形成甲基化碱基、二氢尿嘧啶等。三、rRNA的加工原核和真核细胞合成蛋白质需要大量的核糖体，要求存在大量的rRNA基因拷贝，转录产物是较长的rRNA前体。原核的30S rRNA前体分子被特异的核糖核酸酶切割产生23S、16S和5S rRNA及一个tRNA。RNase催化裂解产生23S和16S rRNA；RNaseE从前体的3端切割产生5S rRNA。大部分真核生物，包括人类，有大于100个拷贝的rRNA基因，18S、5.8S 、28SrRNA基因特征性地成蔟分布并串联重复，RNA聚合酶转录rRNA基因，每转录一次包含18S、5.8S 、28S 的基因即产生一个45S rRNA前体。然后在核仁中进行加工。加工需要核仁小RNA（snoRNA），还涉及前体中18S和28S rRNA区域的大量甲基化。核仁小RNA与一些特异蛋白质偶联构成核仁小核糖核蛋白（snoRNP），以类似snRNP介导的mRNA剪接相似的方式进行加工。5S rRNA基因拷贝存在与以上基因不同的位点，由RNA聚合酶转录，转移到核仁中不再加工且装配到核糖体。1982年美国的Cech等发现四膜虫大核rRNA前体在成熟过程中能进行自我剪接，加拿大的Altman等发现RNaseP分子中的RNA组分，也像RNaseP的全酶分子一样能单独催化tRNA前体5端序列的切除。这些有酶样催化活性的RNA称为核酶（ribozyme）。进一步研究发现核酶的催化活性和其一小段保守序列的构象有关（似一种锤头样结构）。核酶作用的特点：催化自身的RNA或异体RNA；催化效率较酶蛋白低；有一定的特异性；必须有Mg2+的存在。核酶的作用方式为剪切（相当核酸内切酶的作用）或剪接（相当核酸内切酶和连接酶的作用）。第三节 RNA复制一、RNA复制酶某些RNA病毒侵入寄主细胞后，寄主产生RNA复制酶（RNA指导的RNA聚合酶），以病毒RNA为模板，用4种核苷三磷酸为底物合成互补的RNA链，合成方向是53。RNA复制酶的模板特异性很高，例如噬菌体Q的复制酶只能用噬菌体QRNA作模板，而代用与其类似的噬菌体MS2、R17或寄主细胞的RNA都不行。二、病毒RNA复制的主要方式RNA病毒的种类很多，其