酵母RNA含量测定.doc

real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。Mikael Kubista，教授, R&D TATAA Biocenter主任：RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。样品纯度可以在样品稀释时得到改善。我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是“漂亮”的吸光光谱曲线。230nm吸收峰应该低。我们通过利用Experion (Bio-Rad)记录电泳图（electropherogram）检测RNA的质量。当然，最理想的结果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和 18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，这个比率是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novo et al., 2005)。我们主要的结论是：参考基因(reference gene)的稳定性在完整样品（intact）和在降解样品中是有差别的，因此你不应该将完整的样品和降解的样品相比，尤其是你在研究精确的表达差异时。检测核糖体吸收峰值是目前评价RNA完整性的金标准，但其实rRNA仅是mRNA成分完整性的一个代言标记。我们开发了一种基于PCR的分析实验，可以比较一个特定基因的5和 3 端amplicons的比率。通过比较未知样品和完整的对照样品的比率，我们能够利用PCR分析实验衡量mRNA的完整性，与电泳评估/rRNA评估相比更具有直接相关性。为了评价制备RNA的纯度（例如没有抑制剂），我们实行qPCR SPUD分析，既简单易用又免费(Nolan et al., Anal Biochem, in press).Tim Hunter，英国伦敦大学学院（UCL）：你需要建立灵活的操作流程来分离高质量的RNA。样品类型决定着哪一种分离方法是最好的。通常，初步的质量监控检查是在NanoDrop 分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1.8 至2.1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子外显子边界时，我们会同时选择中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37oC下孵育2-4小时，并重新在Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性Cristina Hartshorn,美国Brandeis大学生物学系：我认为高质量RNA是指正确代表细胞内容物的转录池（transcript pool）的RNA。我们实验室非常注重RNA的回收率，尤其是来源于像单个细胞等的微量样品中RNA的纯化，需要尽量减少可能导致核酸降解的操作步骤。因此，我们开发了一种能在同一支试管里连续进行收集细胞、裂解细胞、去除蛋白杂质、逆转录和实时定量PCR等操作的整体流程。这种整个实验在单个试管内进行的方法称为PurAmp (Hartshorn et al., 2005a; Hartshornet al., 2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将RNA结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的RNA库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于RT引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组DNA模板制备来说是必需的一样。PurAmp方法有时要求一个DNase消化的步骤，但是我比较喜欢避免这一步。我尝试过多种DNase操作方法，但结果总是发现回收的RNA比预期的少。这可能是因为最后一步高温失活酶的步骤导致了RNA的水解。一些商品化的手册表明经过“+ / - DNase”处理后的实时PCR循环，特定样品的信号会出现几个循环的Ct漂移（shift）。其实，考虑到每个细胞中特定的基因的拷贝数比该基因表达时的转录产物的拷贝数少得多，这种漂移几乎是难以察觉的，因此，不应该在DNase消化后稀释模板数量。我喜欢一起扩增DNA和RNA模板，最后消减去基因组DNA的拷贝数（详细请见Question 5）。Jim Huggett，佛蒙特州大学（University of Vermont）癌症中心：我们在英国的实验室通常利用Agilent Bioanalyzer评估核糖体RNA条带来评估纯化RNA的质量。然而，由于我们在撒哈拉以南的非洲国家开展许多研究工作，这里仪器缺乏，所以我们要用琼脂糖凝胶电泳来评价rRNA，从而告诉我们核糖体RNA条带是否OK，以及我们的RNA提取工作是否有效；然而，越来越多证据表明，这些rRNA条带的降解不一定意味着mRNA降解。用什么方法进行质量评估是个人的喜好，现有的评估方法还是必需的。Xiuling Zhang,纽约州卫生署（New York State Department of Health）Wadsworth Center:对于从人类组织中分离的RNA样品来说，我的高质量RNA标准是：1. rRNA 比率 28s/18s 1. 1, RNA完整系数 (RIN) 7 (利用Bioanalyzer 2100进行分析)2. 28s和 18s 条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳)3. 比率 260nm/280nm 2.0 (分光光度计测量)。DNA及RNA含量测定方法发布日期：2008-08-11来源：生技网信息中心浏览次数：1072一、光密度测定法 原理 DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260，再推算出其浓度。 一、光密度测定法 原理 DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260，再推算出其浓度。 仪器 分光光度计(紫外可见光两用)。 试剂 水，DNA或RNA溶液。 操作 (1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到lml。 (2)用lml水做空白。 (3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。 (4)每ul中DNA或RNA浓度(ug)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原DNA或RNA样品浓度为2ugul。 (5)如果想要检测样品的纯度，那么还要再测一次280nm处OD值，计算二者的比率，若比率接近2，则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，建议再用酚氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。 (6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质，那么还要测定一次230nm处OD值。 二、琼脂糖电泳测量法 原理 质粒DNA及微量DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，估计其含量。 仪器 紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂)；电泳槽；电泳梳；电泳仪。 试剂 6上样缓冲液：0.25溴酚蓝；40(WV)糖。 10TBE电泳缓冲液：0.89mol/LTris-硼酸；0.02molLEDTANa2pH8.3。 0.8琼脂糖：0.8琼脂糖；100mi 1TBE 5mgmlEB：0.5gEB；100ml三蒸水 操作 (1)用1TBE电泳缓冲液0.8琼脂糖凝胶，加溴化乙锭其终浓度为0.5ugm1。 (2)加热使琼脂糖熔化均匀，取出室温冷却至50-60。 (3)取一块57cm玻璃板，置水平台上，放一微型点样梳，点样梳底部离玻璃平板的距离为0.5-1. 0mm。 (4)将凝胶小心倒在玻璃板上，待冷却后取出点样梳，保持点样孔的完好。 (5)取DNA样品及),DNA标准浓度各lul加入1TBE4ul，加入6上样缓冲液lul，混 匀。 (6)在0.8琼脂糖凝胶点样孔小心点样，记录样品点样次数与点样量。 (7)打开电源开关，电压不超过5Vcm，一般40V，30-40分钟。 (8)取出泳动后的凝胶板，翻转玻璃盖在紫外分析仪观察DNA区带。 (9)DNA含量的估计：比较待测DNA的条带与已知DNA的各条带的荧光密度，估计待测DNA在凝胶中的含量，再估计出其浓度。那要看你用什么方法测定DNA和RNA： （1）紫外吸收法也就是测量OD（260）和OD（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。 （2）荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。 纯化DNA可以买试剂盒，主要有膜吸附法，磁珠分离法，都很方便。RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。 1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。 3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。 4.显色反应： 鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA - 绿色化合物 DNA - 蓝紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。 DNA和RNA的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。 5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。 6.紫外吸收：核酸的m260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。 7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度从达到小依次为：RNA ; 超螺旋DNA 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA，最下面是RNA。 8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。 9.DNA分子量测定最直接的方法：用适当浓度的EB（溴嘧啶）染色DNA，可以将其他形式的DNA变成线形DNA，用电镜测出其长度，按B-DNA模型算出bp数，根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 DNA是双螺旋结构，RNA是单螺旋结构的。 具体解释如下： RNA指 ribonucleic acid 核糖核酸 核糖核苷酸聚合而成的没有分支的长链。分子量比DNA小，但在大多数细胞中比DNA丰富。RNA主要有3类，即信使RNA（mRNA），核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）。这3类RNA分子都是单链，但具有不同的分子量、结构和功能。 在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。 DNA 指deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸(染色体和基因的组成部分) 脱氧核苷酸的高聚物，是染色体的主要成分。遗传信息的绝大部分贮存在DNA分子中。 分布和功能 原核细胞的染色体是一个长DNA分子。真核细胞核中有不止一个染色体，每个染色体也只含一个DNA分子。不过它们一般都比原核细胞中的DNA分子大而且和蛋白质结合在一起。DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息；策划生物有次序地合成细胞和组织组分的时间和空间；确定生物生命周期自始至终的活性和确定生物的个性。除染色体DNA外，有极少量结构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。DNA病毒的遗传物质也是DNA。 结构： DNA是由许多脱氧核苷酸残基按一定顺序彼此用3，5-磷酸二酯键相连构成的长链。大多 数DNA含有两条这样的长链，也有的DNA为单链，如大肠杆菌噬菌体X174、G4、M13等。有的DNA为环形，有的DNA为线形。主要含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶4种碱基。在某些类型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶，其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富，可达6摩尔。在某些噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期，查加夫（E.Chargaff）发现不同物种DNA的碱基组成不同，但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数（A=T），鸟嘌呤数等于胞嘧啶数（G=C），因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和。一般用几个层次描绘DNA的结构。 一级结构 DNA的一级结构即是其碱基序列。基因就是DNA的一个片段，基因的遗传信息贮存在其碱基序列中。1975年美国的吉尔伯特（W.Gilbert）和英国的桑格（F.Sanger）分别创立了DNA一级结构的快速测定方法，他们为此共获1980年度诺贝尔化学奖。自那时以后，测定方法又不断得到改进，已有不少DNA的一级结构已确立。如人线粒体环DNA含有16569个碱基对，噬菌体DNA含有48502个碱基对，水稻叶绿体基因组含134525个碱基对，烟草叶绿体基因组含155844个碱基对等。现在美国已计划在10至15年内将人类DNA分子中全部约30亿个核苷酸对序列测定出来。 二级结构 1953年，沃森（Watson）和克里克（Crick）提出DNA纤维的基本结构是双螺旋结构，后来这个模型得到科学家们的公认，并用以解释复制、转录等重要的生命过程。经深入研究，发现因湿度和碱基序列等条件不同，DNA双螺旋可有多种类型，主要分成A、B和Z3大类，其主要参数差别如下表。 一般认为，B构型最接近细胞中的DNA构象，它与双螺旋模型非常相似。ADNA与RNA分子中的双螺旋区以及转录时形成的DNARNA杂交分子构象接近。ZDNA以核苷酸二聚体为单元左向缠绕，其主链呈锯齿（Z）形，故名。这种构型适合多核苷酸链的嘌呤嘧啶交替区。1989年，美国科学家用扫描隧道电镜法直接观察到双螺旋DNA。实验三 酵母RNA的提制（浓盐法） 一、目的 学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含 RNA 2.6710.0，DNA很少（0.030.516），而且菌体容易收集，RNA也易于分离，所以选用酵母为实验材料。 RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.02.5，使RNA沉淀，进行离心收集。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料1仪器 （1）量筒（50ml）（2）三角瓶（100ml） （3）烧杯（250ml，50ml，10ml） （4）布氏漏斗（40mm） （5）吸滤瓶（125ml） （6）表面皿（6cm） （7）751型分光光度计 （8）离心机（4000rmin） （9）恒温水浴 （10）药物天平 （11）烘箱2试剂 （l）NaCl（化学纯） （2）6molL HCI （3）95乙醇（化学纯）3材料 鲜酵母或干酵母；pHO.55.0的精密试纸。 四、操作步骤1提取称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。2分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000rmin离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却待冷至10以下时，用6molL HCI 小心地调节pH值至2.02.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000rmin离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95的乙醇 510ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95乙醇510ml淋洗 3次。5干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。6含量测定 将干燥后RNA产品配制成浓度为 1050pgml的溶液，在751型分光光度计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量： 式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lgRNA的吸光度。 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 六、注意事项1用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在2027之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。2加热至90100使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA的提取。核酸外切酶 核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。DNA限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。5.6 菌种筛选方法 所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。因为诱变育种中的筛选工作最复杂，所以，本节主要讨论诱变育种的筛选方法，这些方法也为其它育种方法的筛选提供了借鉴。 5.6.1菌种筛选方案 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步