生化分析与技术.doc

拟南芥psrp3基因的PCR扩增与生物信息学分析拟南芥psrp3基因的PCR扩增与生物信息学分析摘要 采用PCR法获得拟南芥叶绿体核糖体psrp3基因序列并进行生物信息学分析根据psrp3基因序列保守区设计2对引物，通过RT-PCR获得预期大小的基因序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段利用生物信息学软件对拟南芥psrp3基因序列进行同源比对、氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、蛋白质功能及系统进化分析和预测结果表明，RT-PCR获得了一段753 bp的序列，psrp一3蛋白是等电点为927的亲水性稳定蛋白，包含一个结构域和一个区域，a螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件，p折叠和伸展链散布其中，和菠菜、葡萄、蓖麻、大豆等的psrp3蛋白有较高的同源性为进一步了解psrp3基因的功能和作用机制打下基础关键词 拟南芥；叶绿体；psrp一3基因引言叶绿体是植物细胞和真核藻类的重要细胞器，是植物进行光合作用的场所叶绿体是半自主性细胞器，具有自身独立的遗传体系和蛋白质合成的全套机构，包括核糖体叶绿体基因组是植物基因工程研究的热点u剖至2006年底，已经公布了包括不同物种的叶绿体基因组数据82组，这其中包括同一个种的不同亚种J研究发现，叶绿体70S核糖体含有58。62个核蛋白，其中约有23由核基因组编码，其余13由叶绿体基因组编码1虽然组成叶绿体的绝大多数蛋白质都是来自细胞质，但目前在各种植物的叶绿体中已确定了20个电子传递和光合固碳的基因：编码RuBP羧化酶的大亚基，Ps I的2个亚基，Ps的8个亚基，ATP合成酶的6个亚基，细胞色素bf复合物的3个亚基，这些都是叶绿体核糖体所合成的重要蛋白质剖因而，研究叶绿体核糖体的重要基因，不仅可以在分子水平上阐明蛋白质之间的相互作用、光合作用各过程的调控，而且可以了解叶绿体的起源与进化、核质互作关系在叶绿体核糖体中存在着6个特殊的蛋白质(质体特异性核糖体蛋白，plastidspecific ribosomalproteins，psrps)，它们都是由核基因编码其中，psrpl，psrp-2，psrp3，psrp-4位于30S小亚基上，psrp-5，psrp-6位于50S大亚基上b4J叶绿体核糖体只负责合成叶绿体DNA编码的不到一百个多肽，但是其中却包括一些在生物圈中含量最丰富的蛋白质因而，叶绿体核糖体必须能够维持一个比较高的蛋白质合成率，并且必须具备响应光强度的变化而改变蛋白质合成速率的机制为了满足光合成蛋白质的需要和核糖体功能的协调，在长期的进化过程中，叶绿体转录翻译发展了大量叶绿体特异的调控元件定位于核糖体的psrps，就是这样的一套调控元件psrps可能以总体的形式参与叶绿体中蛋白质合成调控，但目前作用机制并不清楚Psrp-3基因在拟南芥存在两个同源基因，分别位于染色体I和染色体V(ATlG68590，AT5G15760)上ATlG68590可以表达，AT5G15760不转录，有可能是伪基因或沉默基因，只在特殊条件下才会表达怕Jpsrp3基因所编码的psrp3蛋白存在两种形式，一种是N末端经过翻译后修饰，一种未修饰这两种形式之间的比率是否固定目前尚不清楚，很可能依据光照强度和光照时间的改变而变化【3,6psrp3蛋白质参与光介导的叶绿体蛋白合成，但其在光介导蛋白合成中的具体功能及作用机制，迄今尚无研究报道1材料与方法11材料111植物材料拟南芥(Arabidopsis thalianaecotype Columbia)Columbia生态型(col一0)培养条件：光照强度I3 000 Ix，光暗周期为12 h12 h，温度为(251)，相对湿度约70生物信息学分析以NCBI数据库中的拟南芥psrp-3基因(ATl G68590)作为研究对象112茵株和质粒大肠杆菌JMl09、质粒pBIl21载体由南京中医药大学第-I临i床学院针药结合实验室保存113试剂及工具酶TaqDNA聚合酶、反转录酶、dNTP、OligadT等购自宝生物工程(大连)有限公司和上海生工生物公司，DNA分子Marker、DNA回收试剂盒、琼脂糖等其他相关生化试剂购于上海生工生物公司引物由大连宝生物公司合成12方法121拟南芥总RNA提取用Tfizol试剂法提取叶片总RNA：将03 g叶片放在180热处理过的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，然后将粉末放入装有l mLTrizol试剂的Eppendorf管中用宝生物公司提供的RNAiso Reagent试剂盒提取总RNA，经琼脂糖电泳检测总RNA质量122引物设计与psrp-3基因的RTPcR扩增反应根据GenBank已登录的拟南芥psrp3基因序列(ATlG68590)，设计合成引物【10并根据植物双元载体pBIl21的多克隆酶切位点，分别设计2条含有Sac I和XbaI限制性内切酶位点的PCR引物上游引物R：5CGTCCA7唧AGACAcAAAA7rCTCCA田GT形硼盼3，下游引物L：5 7ArCGAGAGCTCAA CIcAGAGTrGCIIGATGIqqB3以拟南芥RNA为模板，R和L为引物，进行RT-PCR扩增在PCR管中加入总RNA 8皿，Oligo dT 2皿置于705 min，然后放于冰上；再依次加入5 x Buffer 4 gL，10 mmolL dNTP 2ttL，AMVl汕，RNase Inhibitor 1肚，42放置60 min，冰上冷却，产物置于70保存50L PCR反应体系为：Ex-Taq25L，cDNA2L，引物R和L各1L，去离子水补至50L反应条件为：预变性94，2 rain；循环参数，94，30 s；52，30 s；72，1 min 30 s；循环数35；最后延伸，72，5 min；4保存PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下割取含有目的片段的凝胶，由试剂盒回收PCR产物，将回收的片段与pBll21载体连接，转化大肠杆菌JMl09，通过菌落PCR方法筛选重组子，提取阳性克隆的质粒DNA，由大连宝生物公司完成测序123蛋白序列同源性分析和系统进化树构建利用NCBI数据库中的Blot软件将目的基因编码的氨基酸序列与GenBank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索，获得玉米、葡萄、大麦、蓖麻、水稻、拟南芥和大豆等物种的序列数据和信息进而利用ClustXl83软件进行多序列同源性比对和聚类分析【13-14聚类分析包含以下20个物种的序列：蓖麻(Ricinus communi8(castor bean)，XP-0025291 30)、毛果杨(Populus trichocarpa，XP-IX)23 15948)、葡萄(Vitisvinifem，CAN68341)、菠菜(Spinacia oleracea，P82412)、大豆(Glycine lI瞰，ACUl4369)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，ACJ86010)、北美云杉(Picea sitchensis，ABK26571)、玉米(zea mays，NP-001148519)、水稻(Ormsativa，NP-001052994)、高梁(Sorghum bicolor，XP-002446621)、醉蝶花(Cleome spinosa，ABD96848)、小立碗藓(Physcomitrella patens subsppatens，XP001778658)、大麦(Hordeum vulgare，048609)、绿球藻(Chlorokybus atmophytieus，m001019068)、紫红紫菜(Porphyra purpurea，NP-053961)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis，YP-537032)、蓝细菌(Synechococcus spCC9902，m376514)、囊泡藻(Vauchefia litorea，L002327484)和赤潮异弯藻(Heterosigtm akashiwo，YP-001936340)进化树使用MEGA4软件的邻接归并法(NJ法)构建，Kimum两参数模型(Kimura 2-parameter)，自展检验(bootstrap analysis)重复l 000次2结果21拟南芥psrp3基因的PCR扩增及鉴定提取的总RNA纯度高(见图1)，通过琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明RNA有略微降解，28sRNA的亮度与18sRNA亮度相若以提取的总RNA反转录的cDNA为摸板，用psrp3基因的特异引物对cDNA进行PCR扩增，扩增产物经l琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图2)，得到的扩增条带为约750 bp的单一条带，与目的片段大小相同所得产物回收后，将该片段连接到pBll21载体上，转化大肠杆菌JMl09，得到重组质粒，委托大连宝生物公司实验室测序，所得结果用BLAST软件在生物信息学数据库中进行搜索，发现和NCBI数据库中的拟南芥psrp一3基因(ATlG68590)序列完全一致，说明所扩增的条带为psrp3基因cDNA克隆22 psrp-3蛋白的基本理化性质分析对基因序列及其氨基酸羊列进行分析发现，psrp3基因cDNA全长753 bo，有1个开放阅读框(核苷酸59556)，编码l条166个氨基酸残基的蛋白质，由l条44个氨基酸的转运肽和121个氨基酸的成熟蛋白组成对所推测氨基酸序列进行分析表明，该蛋白相对分子质量为18 4724，等电点为927，负电荷残基(Asp+Gh)总数为13，正电荷残基(Arg+Lys)总数为17，分子式为C,832H1333N2170&，原子总数为2 632，不稳定系数为3835，该蛋白分类为稳定蛋白脂肪系数为8928，亲水性评估为一0212，依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可见该蛋白为亲水性蛋白该蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Ser(18个，占108)，含量比较少的氨基酸是Tyr(1个，占06)相较于藻类和光合细菌psrp3，拟南芥成熟psrp3有1个延长的N末端和1个截断的c末端23系统发育分析我们将玉米、大麦、水稻、拟南芥、葡萄、苜蓿、菠菜、蓖麻、毛果杨、云杉和大豆等20个物种的psrp3序列集合到一起，进行多重序列比对，根据psrp一3序列揭示的遗传分化距离，采用邻接法构建并绘制了系统进化树分析表明，供试物种的psrp3序列具有非常高的同源性，这种高同源度在保守的功能结构区域YcF65更为明显从构建的进化树可以看出，供试的20个物种的psrp3被聚成两个大类囊泡藻和赤潮异湾藻的psrp。3聚为一类拟南芥、物种的荔雪善p萄、srp要3羹然裟翼蓁舅兰霎，：矗 一聚为另一类水生植物绿球藻聚为一支，而陆生的拟南芥、蓖麻、葡萄等高等植物和低等植物小立碗藓聚为另一支其中，拟南芥、蓖麻、毛果杨、葡萄、菠菜、大豆和蒺藜苜蓿等双子叶植物的psrp一3聚为一分支：蓖麻和毛果杨聚成一组，豆科的大豆和蒺藜苜蓿聚成一组；而水稻、高粱、大麦和玉米等单子叶植物的psrp一3聚为另一分支3讨论随着DNA序列研究的广泛开展，对植物叶绿体基因组的研究发现，其具有下列特性：叶绿体DNA呈单亲遗传，极少(或没有)发生重组，极少或没有种内变异，且不受基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的进化路线，不依赖于其他任何数据即可构建分子系统树、查明植物的进化历史因而对叶绿体的重要基因进行分析，可从进化和系统发育上，揭示物种亲缘关系和阐述生物遗传多样性，并已有大量关于利用细胞器DNA或基因来进行遗传与进化的研究和报道psrp3位于核糖体30S小亚基上，不与rRNA连接，是一个进化上保守的叶绿体核糖体蛋白，YCF65(ycf65基因产物)是它在光合蓝细菌中的同源蛋白i6-9jpsrp3被认为做为调控因子参与叶绿体蛋白质合成的光调控，但作用机制目前尚不清楚b驯本文对拟南芥叶绿体基因组中的psrp3基因进行了PCR扩增和生物信息学分析用BLAST对psrp-3进行同源性分析显示，psrp-3同源基因产物在非光合的真核生物基因组及古细菌基因组中不存在，而在光合细菌及高等植物的基因组中存在，并且psrp3蛋白的同源性在高等植物中高(7l83)，而与藻类及光合细菌的同源性低(3656)这种高同源度在保守的功能结构区域YcF65，更为明显发现该区域氨基酸水平上的同源性较高，说明叶绿体基因组具有高度的保守性，可以为物种系统学与遗传多样性的研究提供有用的信息利用psrp3氨基酸序列，对物种进行聚类分析能够较好地反映物种间亲缘关系的远近，结果显示。拟南芥、蓖麻、毛果杨、葡萄、菠菜、大豆和蒺藜苜蓿聚成一类，说明它们具有相近的细胞质起源除低等植物小立碗藓和北美云杉划分为一个子分支与植物学分类结果不符外，其余均与植物学分类的结果一致，这可能与该基因中遗传密码子的变异有关，暗示仅以氨基酸序列为指标研究植物系统关系的结果并不确切，应该与传统植物学分类的结果相对应单、双子叶植物各成一支，分化明