最强的生物化学笔记.doc

2014年考研生物化学辅导班课程说明 本课程围绕生物化学通用版本王静岩生物化学第三版上下册及国内其他教材，并在课程中引入国外教材Lehninger Principles of Biochemistry 第五版本。 课程分为三个阶段： 第一阶段 结合课本深入剖析重点难点（65个课时） 第二阶段 结合该校考研真题重点分析（45个课时） 第三阶段 串讲冲刺指导 （15个课时） 课程赠送一下资料：报考学校的真题，课件，笔记等等。 如果你不会制定专业课学习计划，只要你报了本辅导班，本辅导班可以帮你解决一切专业的问题。我们有强大的团队，可以帮你解决专业课复习当中的问题。 附赠2012年课程讲义部分报名联系QQ 100940168 QQ 1519142633第一章 蛋白质化学非极性R基带负电荷R基本章结构简图 不带电荷极性R基 稀有氨基酸常见氨基酸20种带正电荷R基种类 构件分子氨基酸酸碱性质-等电点光吸收特性化学性质性质分配柱离子交换纸层析Rf薄层层析分离一级结构超二级结构高级结构二级结构蛋白质三级结构结构与功能结构域四级结构结构与功能关系分子大小溶解度蛋白质性质：酸碱；大小；胶体性质电荷蛋白质分离：不同原理分离分析蛋白质鉴定：分子量；纯度；浓度吸附能力生物学亲和力 第一节 蛋白质通论 一、蛋白质的功能多样性蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。自然界中最小、最简单的生物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。没有蛋白质也就没有生命。自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多。概括起来，蛋白质主要有以下功能：1.催化功能 生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。2.结构功能 蛋白质可以作为生物体的结构成分。在高等动物里，胶原是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的1/4。细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。3.运输功能 脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。4.贮存功能 某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。5.运动功能 肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。6.防御功能 高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。7.调节功能 某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。8.信息传递功能 生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。例如，视觉信息的传递有视紫红质参与，感受味道需要味觉蛋白。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。9.遗传调控功能 遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。10.其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。如某些植物在被昆虫咬过以后会产生一种毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。二、蛋白质的水解【常见考点】氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发现是从蛋白质的水解得到的。蛋白质的水解主要有三种方法：1.酸水解 用6MHCl或4MH2SO4，105回流20小时即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。用3mol/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其含量。2.碱水解 用5MNaOH，水解1020小时可水解完全。碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。常用于测定色氨酸含量。可加入淀粉以防止氧化。3.酶水解 酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。 第二节 氨基酸 一、 20种氨基酸简述名称英文三字符单字符结构特性甘氨酸glycineGlu G无手性C丙氨酸alanineAla A缬氨酸valine Val V大脂肪侧链亮氨酸leucineLeu L异亮氨酸isoleucine Ile I甲硫氨酸methionineMet M脯氨酸prolinePro P唯一成环氨基酸，氨基酸的侧链既与a-碳原子结合又与a-氨基N-原子结合，缺少H-bond donor，无法形成螺旋结构苯丙氨酸phenylalaninePhe F侧链有芳香环,疏水氨基酸酪氨酸tyrosine Tyr Y酪氨酸的芳香环有一个羟基。与其他氨基酸侧链呈化学惰性相比，酪氨酸的羟基有化学反应性，疏水性弱。色氨酸tryptophanTrp W吲哚基团替代丙氨酸侧链的氢原子。吲哚基团有的两个环融合在一起，一个环有NH基团。有NH故疏水性弱。丝氨酸serineSer S侧链有极性但不带电荷。侧链有羟基与脂肪链相连。亲水，其反应活性比丙氨酸和缬氨酸大得多。苏氨酸threonineThrT侧链有极性但不带电荷。侧链有羟基与脂肪链相连。亲水，其反应活性比丙氨酸和颉氨酸大得多。有第二个不对称碳原子，但蛋白质的苏氨酸只有一种构型。天冬酰胺asparagineAspA极性但不带电荷。含酰胺的极性氨基酸谷氨酰胺glutamine Gln Q极性但不带电荷。含酰胺的极性氨基酸半胱氨酸cystein eCys C极性不带电。结构上类似苏氨酸，但是用巯基替代了羟基。巯基比羟基活泼。一对巯基靠近可以形成二硫键，稳定蛋白质的结构。赖氨酸lysineLys K带电荷的氨基酸，高度亲水，侧链长，末端是氨基，在中性pH时侧链末端带正电荷。精氨酸arginineArg R带电荷，高度亲水，侧链长，末端是胍基，在中性pH时侧链末端带正电荷。组氨酸histidineHis H带电荷，高度亲水，侧链含有咪唑基，咪唑基是芳香环，可质子化后带正电荷。咪唑的pKa值接近于6，在中性pH附近的溶液中咪唑基既可质子化也可不带电荷，取决于咪唑基团所在的局部环境。组氨酸常在酶的活性中心。在酶促反应中咪唑环既可结合质子，又可释放质子。天冬氨酸aspartate Asp D酸性氨酸。常被称为天冬氨酸盐，主要是强调在生理pH溶液中侧链基团解离，因此带负电荷。在有些蛋白质中这两种氨基酸的作用是接受质子，对蛋白质功能起重要作用。谷氨酸glutamate Glu E酸性氨酸。主要是强调在生理pH溶液中侧链基团解离，因此带负电荷。在有些蛋白质中这两种氨基酸的作用是接受质子，对蛋白质功能起重要作用。 1.按照R 基的化学结构分类（1）R 为脂肪烃的氨基酸（5 种）：Gly、Ala、Val、Leu、IleA. R 基为中性烷基（Gly 为H ），对分子酸碱性影响很小，几乎有相同的等电点（6 .0）B. 从Gly 至Ile，R 基团疏水性增加，Ile 是这20 种3氨基酸中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3 以外）C.一般位于在蛋白质内部，侧链不被修饰（2）R 中含有羟基的氨基酸（2 种）：Ser 和ThrA. Ser 的-OH 基是极性基团，易与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义，在大多数酶的活性中心都发现有Ser 残基B. Thr 中的-OH 是仲醇，具有亲水性，但形成氢键的能力较弱，在酶的活性中心很少出现（3）R 中含硫的氨基酸（2 种）：Cys、MetA. Cys（半胱氨酸）R 中含巯基-SH 两个Cys 的-SH 氧化生成二硫键，生成胱氨酸。Cys -SH+ Cys -SH Cys-S-S- Cys ，二硫键利于蛋白质结构的稳定B. Met 中含有甲硫基（-S-CH3 ）在生物合成中是一种重要的甲基供体（4）R 中含有acidic group 的氨基酸（2 种）：Asp、Glu Asp 侧链羧基pKa（-COOH）为3.86；Glu 侧链羧基pKa（-COOH）为4.25 它们在生理条件下带有负电荷（5）R 中含有酰胺基团的氨基酸（2 种）：Asn、Gln易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义。（6）R 中含氨基的氨基酸（2 种）：Basic amino acids，Lys、ArgA. Lys 的R 侧链上含有一个氨基，pKa 为10.53，生理条件下Lys 侧链带有一个正电荷。此外，它的侧链有4 个C，柔性较大，使侧链氨基的反应活性增大B. Arg 是碱性最强的氨基酸，pKa 为12.48，生理条件下完全质子化（7）R 中含有芳香基的氨基酸（2 种）：Phe、Tyr都具有共轭 电子体系， 易与其它缺电子体系或 电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)，在分子相互识别过程中具有重要作用。这2 种氨基酸在紫外区有特征吸收峰。（8）R 为杂环的氨基酸（3 种）：Trp 、His、ProA. 在280nm，Trp 吸收最强，Tyr 次之，Phe 最弱B. His 的咪唑环pKa 在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa 为6.00，后者为7.35，它是20 种氨基酸中侧链pKa 值最接近生理pH 值的一种，在接近中性pH 时，可离解平衡，具有缓冲能力C. Pro 是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。多肽链中，Pro 残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用。2. 按照R 基的极性可以分为4 类（1）非极性氨基酸Nonpolar amino acids（8 种）Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro，在水中溶解度较小，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。（2）不带电荷的极性氨基酸Polar, uncharged amino acids（7 种）Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln 、Gly，这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。（3）带负电荷的氨基酸（酸性氨基酸）Acidic amino acids（2 种）：Glu 和Asp（4）带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）Basic acids（3 种）Arg、Lys、His非极性氨基酸一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的氨基酸和极性氨基酸位于蛋白质表面。酶的活性中心：His、Ser常考习题 以题巧记1人体八种必须氨基酸:. “一两色素本来淡些”（异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、缬氨酸）。2 下列氨基酸中哪一种不具有旋光性？ ALeu BAla CGly DSer EVal 解析：Gly不具有旋光性 所以选C3.有一个蛋白分子在pH7的水溶液中可以折叠成球状，通常是带极性侧链的氨基酸位于分子外部，带非极性侧链的氨基酸位于分子内部。请解析：（1）在Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile、His中，哪些位于内部？哪些位于分子外部？（2）为什么在球状蛋白内部和外部都发现Gly和Ala？（3）Ser、Thr、Asn、Gln都是极性氨基酸，为什么会在内部发现？（4）在球状蛋白的分子内部和外部都能找到Cys，为什么？解析：（1）带有非极性侧链的氨基酸残基：Val、Pro、Phe、Ile位于分子内部；带有极性侧链的氨基酸残基：Asp、Lys、His位于分子外部。（2）因Gly和Ala的侧链都比较小，疏水性和极性都小；Gly只有一个H与-碳原子相连，Ala只有CH3与-碳原子相连，故它们即可出现在分子内部，也可出现在分子外部。（3）Ser、Thr、Asn、Gln都是极性氨基酸，但它们在pH7.0时含有不带电荷的极性侧链，参与分子内部的氢键形成，从而减少了它们的极性。（4）在球状蛋白内部可见Cys，因其常常参与链内和链间的二硫键的形成，使其极性减少。4.、天然蛋白质中不存在的氨基酸是：（C）A、半胱氨酸 B、脯氨酸 C、瓜氨酸 D、丝氨酸5.下列氨基酸哪个含有吲哚环（ C） A Met B Phe C Trp D Val 6.含有咪唑环的氨基酸是（C） A Trp B Tyr C His D Phe 7 下列氨基酸中，哪一个含氮量最高（A ） A Arg B His C Gln D Lys 8.在蛋白质成分中，在280nm处有最大光吸收的成分是（D） A Tyr 酚环 B Phe 苯环 C His 咪唑环 D Trp 吲哚环 重点解析 在280nm吸光值升高的有Trp，Tyr ，Phe 配合知识点记忆9.蛋白质的内源荧光主要来源于酪氨酸和色氨酸10.Tyr苯环上的-OH大约解离为0.01%,其PI值按R为极性非游离氨基酸计算，实验测得Tyr的PK1=2.20，PK2=9.11，PKR=10.07，Tyr的PI应为（D） A 6.135 B 5.035 C 9.59 D 5.6611. 下面哪种多肽在280nm具有更大的吸收? A:Gln-Leu-Glu-Phe-Thr-Leu-Asp-Gly-Tyr B:Ser-Val-Trp-Asp-Phe-Gly-Tyr-Trp-Ala 解答：在280nm的吸收与Trp和Tyr有关，因为这两种氨基酸在280nm处具最大吸收，而Phe的最大吸收再260nm。由于多肽B含有2个Trp残基和1个Tyr残基，而多肽A只含有一个分子Tyr。因此多肽B在280nm处具有更大的吸收二、 氨基酸的性质（一）物理性质1.熔点溶解：氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在。所以氨基酸晶体是离子晶体，熔点在200以上。-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。 2.旋光性除甘氨酸外，-氨基酸都有旋光性，-碳原子具有手性。苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。从蛋白质水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物体内特别是细菌中，D-氨基酸也存在，如细菌的细胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。 3.紫外吸收三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，F:257nm,=200; Y:275nm,=1400; W:280nm,=5600。通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的，一般在280nm。（二）化学性质 1.氨基酸两性性质（1）两性解离性质(Zwitterion)晶体溶点高，离子晶体，不是分子晶体不溶于非极性溶剂介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低），水溶液中的氨基酸是极性分子氨基酸在水溶液中以两性离子形式存在的原因：-羧基pK1 约2.0，pH3.5 时，-羧基以COO-形式存在-氨基pK2 约9.4，pH pI 时，-COOH 解离成-COO-，氨基酸带负电荷，向正极移动pH = pI 时，氨基酸净电荷为零pH pI 时，带负电荷，向正极移动pH = pI 时，净电荷为零pH pI 时，带正电荷，向负极移动2.氨基的反应（1）酰化氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。该反应在多肽合成中可用于保护氨基。（2）与亚硝酸作用氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。因为伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度较慢。常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。（3）与醛反应氨基酸的-氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N-。西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。赖氨酸的侧链氨基也能反应。氨基还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。（4）与异硫氰酸苯酯(PITC)反应-氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。（5）磺酰化氨基酸与5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应，生成DNS-氨基酸。产物在酸性条件下(6NHCl)100也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。（6）与DNFB反应氨基酸与2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100高温。该反应曾被英国的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂，现在应用于蛋白质N-末端测定。（7）转氨反应在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。3.羧基的反应羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。羧基可与醇生成酯，此反应常用于多肽合成中的羧基保护。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。将氨基保护以后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在脱羧酶的催化下，可脱去羧基，形成伯胺。4.茚三酮反应氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝色物质。而脯氨酸生成黄色化合物。根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。5.侧链的反应丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。半胱氨酸侧链巯基反应性高：（1）二硫键(disulfide bond)半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可以打开二硫键。在研究蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相应的磺酸。还原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。由于半胱氨酸中的巯基很不稳定，极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它保护起来，防止它重新氧化。（2）烷化半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正电的侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。（3）与重金属反应极微量的某些重金属离子，如Ag+、Hg2+，就能与巯基反应，生成硫醇盐，导致含巯基的酶失活。6. 以下反应常用于氨基酸的检验：（1）酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应(Pauly反应)，可用于定性、定量测定。组氨酸生成棕红色的化合物，酪氨酸为桔黄色。（2） 精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应。用于胍基的鉴定。（3）酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。（4）色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环，用于鉴定吲哚基。在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反应很慢甚至不反应。【常考考点】 以题巧忆例题：1.计算天冬氨酸（pK1=2.09, Pk2=3.86, pK3=9.8）及赖氨酸, （pK1=2.09, Pk2=3.86, pK3=9.8）的PI值。（南京工业大学2002年）2.下列那哪个氨基酸含有羟基（ ） （浙江工业大学2004）A丙氨酸 B亮氨酸 C异亮氨酸 D丝氨酸2如何用茚三酮反应定量测定氨基酸含量？答案：茚三酮在弱酸性溶液中与-氨基酸共热，反应生成紫色物质。用纸层析或柱层析把各种氨基酸分开后，利用茚三酮显色并用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸含量。定量释放的CO2可以用测压法测量，从而计算出参加反应的氨基酸量 3. 异亮氨酸有几种光学异构体？答案：异亮氨酸（及苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸）除了-碳原子是一个不对称碳原子外，还有第二个不对称碳原子，因此有四种光学异构体，分别为L-异亮氨酸，D-异亮氨酸，L-别异亮氨酸，D-别异亮氨酸 第三节蛋白质的结构 一、蛋白质通论（一）化学组成与分类1. 元素组成所有的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还含有硫、磷和一些金属元素。蛋白质平均含碳50，氢7，氧23，氮16。其中氮的含量较为恒定，而且在糖和脂类中不含氮，所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。如常用的凯氏定氮：蛋白质含量蛋白氮6.25其中6.25是16的倒数。2. 氨基酸（amino acid）组成蛋白质：20 种L-型氨基酸组成的长链分子3. 分类（1）按照分子形状分类.球状蛋白 外形近似球体，多溶于水，大都具有活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于10。.纤维状蛋白 外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。（2）按照分子组成分类 简单蛋白 完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为以下7类：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。 结合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。4. 生物体内的含量和种类含量（干重）：微生物50-80%；人体45%； 一般细胞50%种类： 大肠杆菌3000；人体35000 左右；生物界1010-1012（二）蛋白质分子大小与分子量：少于50 amino acidspeptide 多于50 amino acidsprotein蛋白质分子量= 氨基酸残基数 110氨基酸平均分子量138，加权平均分子量128，扣除1 个水分子1蛋白质的分子量测定（1）根据化学组成测定最低分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。【常考考点】 以题巧忆1已知血红蛋白含铁0.34%，血红蛋白的最小相对分子量是多少？实验表明，血红蛋白的相对分子量为64500，实际上一个血红蛋白含几个铁原子？解析：血红蛋白的最小相对分子量=56（铁的原子量）0.34% 16400一个血红蛋白含铁原子=645001640042氨基酸的定量分析表明牛血清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相对分子量为204）。（1）试计算牛血清蛋白的最小分子量（假设第每个蛋白质分子只含有一个色氨酸）（2）凝胶过滤测得的牛血清蛋白相对分子量为70000，该血清蛋白分子中含几个色氨酸分子？解析：（1）牛血清蛋白的最小分子量=2040.58%35200（2）该血清蛋白分子中含色氨酸分子数=700003520023. 肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量可依下式计算：最低分子量铁的原子量铁的百分含量100计算结果为16700，与其他方法测定结果极为接近，可见肌红蛋白中只含一个铁原子。真实分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n1。血红蛋白铁含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因为含4个铁原子，所以n4，因此其真实分子量为66800。有时蛋白质分子中某种氨基酸含量很少，也可用这种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000，所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量 4.测得一种蛋白质分子中Trp残基占总量的0.29%，计算该蛋白质的最低相对分子质量？解答 Trp残基/蛋白质 Mr=0.29% 蛋白质Mr=Trp/0.29%=(204-18)/0.29%=64138 5.一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质的最低相对分子量？ 解答：亮氨酸和异亮氨酸的相对分子量都是131，根据两种氨基酸的含量来看，异亮氨酸：亮氨酸=2.18%：1.65%=1.5:1=3:2.所以在此蛋白质中的亮氨酸至少有2个，异亮氨酸至少有3个，那么1.65%+2*（131-18）/蛋白质Mr 蛋白质Mr=226/1.65%=13697 答 此蛋白质最低相对分子质量是13697.二、肽peptide（一）肽和肽键的结构一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。肽键：氨基酸间脱水后形成的酰氨键。两个氨基酸形成的肽二肽。少于10 个氨基酸的肽寡肽。多于10 个氨基酸的肽多肽。肽键的结构特点：（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性，个原子几乎处在同一平面内（酰氨平面）。（3）肽键亚氨基在pH 0-14 内不解离（4）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro 的肽键可能出现顺、反两种构型（二）肽的重要性质1. 旋光性：一般短肽的比旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和2. 肽的酸碱性质在pH 014 范围内，肽键中的亚氨基不解离。肽的酸碱性质主要取决于端2和端COOH 以及侧链上可解离的基团。在长肽或protein 中，可解离的基团主要是side groups。3. 肽的化学反应肽的-羧基，-氨基和侧链R 基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定性、定量分析。双缩脲反应是peptide 和protein 特有的反应，游离氨基酸无此反应。CuSO4 与双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色复合物。（三）天然存在的活性肽活性肽：生物体内有很强生物活性的寡肽或多肽1. 谷胱甘肽GluCysGly在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基。维护protein 活性中心的巯基处于还原状态。2GSH GSSGH2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG2. 短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的10 肽环，抗菌。L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-PheL-ProL-VaOrn鸟氨酸3. 脑啡肽（5 肽，具有镇痛作用，已发现几十种。）Met-脑啡肽： TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽： TyrGlyGlyPheLeuLeu-脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。生物体内多肽或寡肽的来源A. protein 合成后的剪切、修饰B. 酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）C. 动物肠道可吸收寡肽4. 生物体内寡肽的来源：（1）合成蛋白质的剪切、修饰（2）酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）（3）动物肠道可吸收寡肽三、Sequence primary structure（一级结构序列，共价结构）一级结构意义：protein 一级结构（序列）中含有形成高级结构全部必需的信息， 一级结构决定高级结构及功能。推断：氨基酸序列（一级结构）空间结构预测：空间结构（高级结构） 功能蛋白质测序步骤（一）protein 测序的一般步骤1. 测定protein 分子中多肽链的数目2. 拆分protein 分子中的多肽链3. 测定多肽链的氨基酸组成4. 断裂链内二硫键5. 分析多肽链的N 末端和C 末端6. 多肽链部分裂解成肽段7. 测定各个肽段的氨基酸顺序8 . 确定肽段在多肽链中的顺序9 . 确定多肽链中二硫键的位置（二）protein 测序的基本策略对于一个纯protein，理想的方法是从N 端直接测至C 端，目前只能测60 个N 端氨基酸。1. 直接法（测protein 的序列）两种以上特异性裂解法：N CA 法裂解A1 A2 A3 A4B 法裂解B1 B2 B3 B42. 间接法（测定核酸序列，推断氨基酸序列）（三）测序前的准备工作1. protein 的纯度及均一性鉴定要求：纯度97%以上，均一两种以上纯度鉴定方法才可靠聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）测N 端氨基酸2. 测定分子量用于估算氨基酸残基数n = M/110方法：SDS-PAGE、凝胶过滤法、沉降系数法、渗透压法3. 确定亚基种类及数目拆离四级结构：SDS-PAGE 测亚基分子量， 8mol/L 尿素，SDS拆离二硫键过甲酸氧化SS + HCOOOH SO3H 或巯基乙醇还原举例：血红蛋白(22)分子量：M 拆亚基：M1、M2 两条电泳带拆二硫键：M1 、M2 两条电泳带分子量关系： M = 2M1 + 2M24. 测定氨基酸组成酸水解、碱水解确定肽链中各种氨基酸出现的频率，便于选择裂解方法及试剂5. 端基分析N 端分析DNS-Cl 法：黄绿色荧光，灵敏度高，薄层层析，方法简便DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，液相色谱等PITC 法：Edman 法，逐步切下，无色PTH-氨基酸，液相色谱分析C 端分析A肼解法H2N-A-B-C-D-COOH无水肼NH2NH2，100，5-10hA-NHNH2、B-NHNH2、C-NHNH2、D-COOH 氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C 端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg 不能用此方法B羧肽酶法（Pro 不能用此方法）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys 外的所有C 端氨基酸羧肽酶B：只水解Arg、Lys（四）肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1. 化学裂解法溴化氰MetX 产率85%亚碘酰基苯甲酸TrpX 产率70-100%NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）XCys羟胺NH2OH AsnGly 约150 个_氨基酸出现一次2.酶法裂解胰蛋白酶LysX (X Pro)，ArgX_胰凝乳蛋白酶TyrX (X Pro)TrpX，PheX胃蛋白酶Phe(Trp、Tyr、Leu)Phe(Trp、Tyr、Leu)Glu 蛋白酶GluXArg 蛋白酶ArgXLys 蛋白酶XLysPro 蛋白酶ProX3.肽段的分离纯化电泳法根据分子量大小分离离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）：根据肽段的电荷特性分离反相法：根据肽段的极性分离凝胶过滤根据分子量大小分离4. 肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度。常用Cl 法要求： 单带、单峰、端单一（五）肽段的序列测定及肽链的拼接1. Edman 法：一次水解一个端氨基酸（1）耦联PITC HNA-B-C-D pH8-9，40PTCA-B-C-D（2）裂解PTCA-B-C-D + TFA 无水三氟乙醇ATZA + H2NB-C-D（3）转化ATZA PTHAPTC 肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（-氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（-氨基酸）2. DNS-Edman 法用DNS 法测N 末端，用Edman 法提供（n-1）肽段肽3. 有色Edman 法荧光基团或有色试剂标记的PITC 试剂4.自动序列分析仪测序仪器原理：Edman 法，可测6070 肽1967 液相测序仪，自旋反应器，适于大肽段1971 固相测序仪，表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端1981 气相测序仪，用Polybrene 反应器（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol 20-40 肽97%气相：5pmol 60 肽98%5. 肽段拼接成肽链16 肽，N 端H，端法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT法裂解：SEO WTON VERL APS HO重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS（六）二硫键、酰胺及其它修饰基团的确定1. 二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭-SH 胃蛋白酶酶解protein第一向电泳：过甲酸氧化SS生成-SO3H第二向电泳：分离出含二硫键的两条短肽，测序。与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。2. 酰胺的确定AspAsn、GluGln酶解肽链，产生含单个Asx 或Glx 的肽，用电泳法确定是Asp 还是Asn举例：Leu-Glx-Pro-Val 肽在pH=6.0 时，电荷量是Leu+ Pro0 Val-此肽除Glx 外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu 或是Gln3. 糖、脂、磷酸基团位置的确定糖类通过Asn、Ser 与protein 连接，-N-糖苷-0-糖苷脂类：Ser、Thr、Cys磷酸：Ser、Thr、His经验性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)，Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg) Ala-Ser(PO4)【常考考点】以题巧记 1、Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基序列的方法。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再以层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。一个含13个氨基酸残基的多肽链，经Edman降解确定该肽链的氨基酸组成为：Ala、Arg、2Asp、2Glu、3Gly、Leu、3Val。部分水解后得到以下肽段：（1） Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala（2） Val-Asp-Val-Asp-Glu（3） Val-Asp-Val（4） Glu-Ala-Leu-Gly-Arg（5） Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu（6） Leu-Gly-Arg问：推测原始肽链的序列解析：思路是分析这六个片段中重叠部分，结合该肽链的氨基酸组成，可分析出该肽链的原始序列为：Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg 2、有一多肽，其分子式是C55H70O19N10，将其彻底水解后只得到下图中的四种氨基酸。根据上面的条件回答问题：问：（1）该多肽是几肽？（2）该多肽水解后，有几个谷氨酸？（3）该多肽水解后，有几个苯丙氨酸？几个丙氨酸？几个甘氨酸？解析：（1）该多肽水解后产生氨基酸中，都含1个N原子。除谷氨酸外，又各含2个氧原子，只有谷氨酸有4个氧原子。它们的碳氢原子比最大的是苯丙氨酸，为9：11。又根据题中分子式可知该多肽分子共有10个N原子，因此该多肽为10肽。（2）形成10肽时会脱去9个水分子，因此这个10肽彻底水解所得到的10个氨基酸的总和应是C55H70O19N10+9H2O，即C55H88O28N10，氧数折半后去氮数（28-102）/2=4（因为多了几个双氧，就有几个谷氨酸分子），即谷氨酸的个数4。（3）将分子式总和减去这4个谷氨酸，C55H88O28N104 C5H9O4N=C35H52O12N6，可见还有6个氨基酸，而且碳氢比很高，推测这是由于苯丙氨酸的存在所引起的。最多可能有几个苯丙氨酸（C9H11O2N）呢？，将359等于3余8。可见有3个苯丙氨酸，此外还有2个丙氨酸，1个甘氨酸。 3 用什么试剂可以将胰岛素链间二硫键打开与还原？如果要打开牛胰核糖核酸酶链内二硫键，则在反应体系中还必须添加什么试剂？蛋白质变性时，为防止生成的-SH基重新被氧化，可加入什么试剂来保护？答案：（1）.巯基化合物可以打开并还原二硫键，包括巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇（DTT）等，可使参与二硫键的2个半胱氨酸还原为带有巯基的半胱氨酸。（2）变性剂，用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍，它们能与多肽竞争氢键，破坏蛋白质二级结构。（3）加卤化烷如碘乙酸、碘乙酰胺等与巯基作用把它保护起来，防止其重新氧化4要测定蛋白质的二硫键位置，用什么方法？答案：对角线电泳法：1.用胃蛋白酶将靶蛋白切成含有二硫键的较短的肽段。2.将水解后的混合肽段点到滤纸的中央进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同而分开。3.将滤纸暴露在过甲酸蒸气中使二硫键断裂，结果每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。4.滤纸旋转90角进行第二向电泳，含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果偏离对角线。5.肽斑可用茚三酮显色确定，在对角线上的肽段均不含二硫键，而偏离对角线的肽段就是形成二硫键的肽段，测定有关肽段的氨基酸组成，即能确定蛋白质肽链中二硫键配对的情况。目前利用质谱技术也可以测定二硫键 5 分离蛋白质混合物的方法主要是根据蛋白质在溶液中的哪些性质？如果蛋白质溶液中混有大量无机盐，如何简单地进行纯化？答案：1.分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。2.透析法：把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液中进行透析，直到透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止；或用超滤法 6下列信息求八肽的序列。（1）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val。（2）Sanger试剂处理得DNP-Ala。（3）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。（4）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。解答：由（2）推出N末端为Ala；由（3）推出Val位于N端第四，Arg为第三，而Thr为第二；溴化氰裂解，得出N端第六位是Met，由于第七位是Leu，所以Phe为第八；由（4），第五为Val。所以八肽为：Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe。 7 当一种四肽与FDNB反应后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val及其他3种氨基酸；当这四肽用胰蛋白酶水解时发现两种碎片段；其中一片用LiBH4（下标）还原后再进行酸水解，水解液内有氨基乙醇和一种在浓硫酸条件下能与