烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶.doc

实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。掌握过氧化物酶的活性的测定。二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N,N四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺 (NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有种催化体系：AP-TEMED 属化学聚合作用核黄素TEMED 属光聚合作用凝胶孔径的可调性及其相关性质凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b100糊状易断凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。同时还与分子形状及分子电荷有关系。在操作时，可以选用凝胶。因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。因而其分离带清晰度及分辨率高。垂直板电泳：凝胶是在两块间距几毫米的平行玻璃板中聚合。垂直圆盘电泳：凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状。（三）过氧化物酶染色原理过氧化物酶催化过氧化氢释放活性氧，进一步氧化联苯胺使之由蓝色变为褐色。属于活性染色，若酶失活，则不能变色。（四）过氧化物酶活性的测定原理过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白质表示三实验器材电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径57mm，长80100mm玻璃架微量注射器或微量吸管带长针头的注射器日光灯带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管四试剂和材料贮液和工作溶液的配制染色液的配制A液：称取0.4g联苯胺，加入ml冰醋酸，溶解后加入ml蒸馏水随用随配B液： NH4ClC液：EDTA(PH6.0)D液： H2O2按A：B：C：D1：1：1：比例配制测酶活力所需试剂20mmol/l KH2PO4 H2O2 愈创木酚100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）反应混合液：100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。冷却后加入H2O2 19l 混合均匀保存于冰箱中。酶液的制备（）材料：萌发天的高粱玉米小麦种子（）步骤：称取不同植物材料幼苗茎部1g加入20mmol/l KH2PO4 10ml于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min 离心15min。倾出上清液，测出总体积放于冷处。五操作步骤过氧化物酶活性的测定取只光径1cm的比色板，只中加入反应混合液ml、KH2PO41ml 作为校零对照，另一只加入反应混合液ml、酶提取液ml立即开启，秒表记时，于分光光度计上测量吸光值。每隔一分钟计数一次。（A470= -）酶活力 = 凝胶的制备（）分离胶的制备：（小孔径凝胶）PH8.9凝胶浓度将贮液按号：号：水：号5ml：10ml：5ml：20ml比例混匀。用带长针头的注射器快速加入玻璃管中（或两层玻璃板之间），高度约3/4。沿壁加入35ml蒸馏水用于隔绝空气，使胶面平整。静置3060min完成聚合，用滤纸吸去水分。（）浓缩胶制备：（大孔径凝胶）PH6.7凝胶浓度将贮液按号：号：号：号ml：6ml：3ml：12ml比例混匀，按上述方法加到分离胶上方距离管上缘0.5cm处（或两层玻璃板之间，放上样品槽模板）。仔细加入水层，在距管口cm处用日光灯照射进行光聚合。照射67min凝胶由淡黄变为乳白。30完全聚合，在室温下放置3060min。取出样品槽模板，用滤纸吸去多于液体。在电泳槽上下槽中加入稀释10倍的PH8.3电板缓冲液并没过玻璃管顶端（或没过短玻璃板）。（）加样酶提取液：蔗糖：，加少许溴蓝指示剂，混匀。用微量加样器取样品混合液，通过缓冲液，小心加到玻璃管中（或样品凹槽底部）。（）电泳接通电源，调节电压，开始为150V，待样品进入分离胶调整至300V。当指示剂迁移至距下缘cm时，停止电泳，关闭电源。（）染色取出胶条（胶板），于染色液中染色20min，酶带显蓝