实验二、99mTc-葡庚糖酸盐(GH)的直接标 - 北京.doc

实验十七 99mTc-葡庚糖酸盐（GH）的制备及小鼠生物分布研究（25学时）一、实验目的1. 掌握锝-99m配合物直接标记法最佳标记条件的研究方法。2. 熟悉锝的价态和行为。3. 掌握放射性活度的测量方法和定标器的使用。4. 掌握放射化学纯度的层析测定方法。5. 练习并掌握小鼠生物分布实验技术。二、实验原理1. 放射化学实验基础1.1概述放射化学是一门实验性的科学，是化学领域中的一个分支。它与化学理论和实验方法有着密切的联系，但由于它是以放射性同位素作为研究对象。因此，无论在内容和方法上与一般化学又有较大的区别，为了进一步掌握放射化学知识，并用它来指导科学研究和生产实践，准确熟练地掌握放射化学的实验方法和技术是必不可少的。以放射性同位素作为研究对象的放射化学实验，在整个操作过程中始终存在着放射性，而操作量又经常处于10-10mol/L 10-20mol/L或10-8g 10-20g的低浓、微量的范围，因此放射化学实验就必须有它自己的实验方法和操作技术。用一般的称量方法确定放射化学中的实验数据是很困难的，而且是不可能的。在放射化学实验中绝大部分数据的测定是建立在对放射性同位素辐射的测量上。通过对射线的类型、能量、半衰期及其活度的测定，就可观察到被研究对象的质和量以及它的行为和过程。这就要求放射化学的工作人员除了具有化学方面的知识和操作技术之外，还必须掌握核素的基本性质（衰变类型、射线能量、半衰期、毒性级别等），放射性衰变规律，定性或定量测定射线的方法和各种探测仪所适用的范围和精度等有关方面的知识和操作技术。在整个放射化学实验过程中，放射性始终存在。尤其是进行强放操作，由于射线的辐照造成对人体的损害，对材料破坏和引起研究体系的变化以及在实验过程中放射性物质的失散而造成环境污染等，这就给放射化学实验提出了一个特殊问题安全防护。为了确保工作人员的安全，尽可能的减少对环境的污染，使实验能正确而顺利地进行，对每一个放射化学的工作人员来讲，都必须严格遵守防护规定，在整个操作过程中必须有切实可行的防护措施和操作方法。放射化学实验中所研究的放射性核素是在不停地衰变，有很多种核素的寿命很短。因此在对流程的设计和选择、测量方法的确定、数据处理等方面都要考虑到研究的对象是在不断的变化着，时间是一个不可忽略的因素，否则，就会出现“坐失良机”或得到错误的结果。总之，通过放射化学实验应使我们对它的特点、操作方法有所了解和提高，逐步做到准确、快速、安全地进行放射化学操作。1.2放射化学实验室的基本要求与安全操作规程1.2.1 放射化学实验室的基本要求根据国家规定，按实验室中操作放射性物质的量、毒性、操作方式几方面情况，将放射化学实验室分成三类。如表1所列；表1 各级放射性工作场所的最大等效日操作量（单位：Bq）同位素毒性实验室的级别丙级乙级甲级极毒类3.71031.851061.851061.851091.85109高毒类3.71041.851071.851071.8510101.851010中毒类3.71051.851081.851081.8510111.851011低毒类3.71061.851091.851091.8510121.851012在表1中列出得最大等效日操作量尚需根据操作性质，乘以表2中的系数加以修正。表2 操作性质的修正系数操作性质修正系数干式发尘操作0.01产生少量气体，气溶胶的操作0.1一般湿式操作1很简单的湿式操作10在工作场所贮存100一般放射化学实验室应具备以下要求和设备：1.放射化学实验室必须与非放射性工作分开，在放射性工作区中，各实验室应按操作放射性的量，由小至大的方式布置。与实验室无关的一切物品禁止带入。放射化学实验室内的仪器、设备、工具不应拿到非放射性实验使用。2.在放射化学实验室内，地面应光滑、无缝、机械性能好，用易于清除污染的材料铺设，如塑料板、瓷砖、耐酸缸砖和耐酸漆、环氧树脂涂料等等。3.实验桌应由耐酸碱、耐热、易去污的材料做桌面。根据操作放射性的量和操作放射在实验室内设置相应的防护及操作设备，如热室、手套箱、通风柜、防护用的铅砖、铅玻璃、有机玻璃屏等。此外，实验室内还应有专门存放同位素的贮存柜及收集固体废物用的污物桶。总之，放射化学实验室的一切要求和设备都是为了便于操作，易于去污，有益于安全防护三原则而确定的。1.2.2 放射化学实验室安全操作规程1.从事放射性工作人员，在操作之前应认真学校并熟悉国家颁布的“放射防护规定”。2.进入实验室工作之前，实验室应通风510min。工作人员应穿戴好与操作量及方式相应的个人防护用品（如实验服、鞋、帽、口罩、手套等）才能进入实验室。放射化学实验室内的个人防护用品不得在非放射性工作区或公共场所内使用。3.与实验室无关得物品、书籍、纸张等严禁携入。严禁在实验室内饮食、吸烟、喝水。4.操作活性物质时必须戴好手套，所有操作均应在铺有吸水纸得瓷盘中进行。严禁戴手套后任意接触非放射性的仪器、物品、设备等。5.蒸发、灼烧、研磨和烘烤放射性物质应按规定程序进行。6.工作人员皮肤暴露部分如有伤口时，不应操作放射性物质。如有急需，则做好防护措施经主管人员检查后才可操作。7.实验室中发生事故（器皿破碎，溶液打翻、溅洒，个人或仪器设备污染，放射性物质丢失等）应立即报告并及时处理。8.实验完毕前必须做好以下几件工作，才可离开实验室(1)清洗使用过的器皿和手套，并检查是否污染，应将其洗至接近本底。放射性废物必须全部收集，存放在指定地点，不得任意丢失。(2)工作人员离开实验室之前，必须仔细洗手，如有污染应洗至本底。(3)实验后应进行扫除；个人防护用品按指定位置放置；实验室内得非放射性垃圾应经污染检查后，才可倒出实验室。1.3放射化学实验基本操作方法1.放射化学实验前的准备。使用放射性同位素前，必须对同位素的性质，它的化学状态、毒性、比度等参数有确切的了解，根据它的性质和用量确定流程、操作方法和防护措施。2.放射性溶液的移取。严禁倾倒，应用滴管、移液器或注射器进行吸取和转移。3.放射性溶液加热、蒸发和烘干的操作必须在通风柜或工作箱内进行，溶液不得超过容器体积的1/3 1/2.。1.4 放射性废物处理与污染的清除1.4.1 放射性污染的清除1.手套、皮肤上的去污一次性手套如有污染应弃置于专门的放射性废物收集装置内。当手和皮肤上污染时，可先用温水，肥皂洗5min。如污染较严重，则可用各种络和剂或稀HCl进行擦洗。2.玻璃器皿的去污对体积大或污染严重的玻璃器皿，应先用小块棉花或滤纸沾取HNO3或HCl，用镊子擦洗，一般擦34次即可将绝大部分污染清除。用酸擦洗后的器皿用水冲洗至本底。擦洗过的棉花或纸不能丢失，收集后按废物处理。对于污染严重的器皿严禁在擦洗前直接用水冲洗，而造成放射性污染的扩散。体积小的器皿可放在酸或络和剂的溶液中浸泡一定时间，再用水冲洗。3.金属用具的去污去污方法与玻璃器皿的相同，但为了防止去污剂对金属表面的腐蚀，不锈钢用稀HNO3；铝用1HNO3或Na3PO4(不能用强碱或强酸)；铜和铅用稀HCl或H2SO4。1.4.2放射性事故处理在进行放射性操作时应尽可能避免放射性事故的出现，这就要有正确的实验方法，熟练的操作技术，尤其是应有认真负责的工作态度。一旦事故发生后，立即停止其它工作，将污染区标志清楚，并通知邻近及有关人员立即进行处理，防止污染面积扩大，严重事故应报告防护小组一起商讨处理方法。少量放射性物质泼洒或散失时，如液体，则用吸水纸、棉花将其吸干。如果粉末，可先在粉末上滴少量水使其润湿，然后用吸水纸、棉花将其收集。将放射性物质收集后，可先用水加以擦洗，经擦洗而仍未完全清除，则应根据同位素的化学性质选择适当的化学试剂进行洗擦，以提高清除能力。在清洗时，应注意决不应在清洗过程中，由于方法不当反而污染范围扩大，或不经收集和擦洗，就用大量水冲洗放射性散失物是不允许的。一般在清洗过程中，均先擦洗，并由低污染区向高污染区擦抹，擦至近本底或污染区放射性活度不再变化时，才能用水大量冲洗。1.4.3放射性废物处理放射性废物不得任意弃置，必须全部收集加以回收和处理。放射性废物处理可根据半衰期及毒性的不同分以下几种方法进行：1.短半衰期的放射性废物半衰期短的放射性同位素，在较短的时间内全部或大部分已衰变，故一般将它们存放710个半衰期，然后进行测定。确定其尚存放射性活度及有无长寿命同位素混入，将测得的结果与国家规定排放标准进行比较。对液体废物如已达到排放标准则可直接进行排放，或用水稀释至符合国家标准后再进行排放。而固体废物则可在专门设备内烧毁或埋藏于地下。2.中、长寿命的放射性废物原则上都应将这些废物处理后变成比度高、体积小的固体废物。低比度的固体废物如废纸、手套等，可用化学试剂腐蚀，或在专门的焚烧炉内烧毁。由于固体废物的存放或处理设备需要很高费用，因而在实验过程中尽量控制废物量是十分必要的。2.锝的配位化学及核性质锝是第VII族元素，其电子结构为4d55s2,所以能以17的价态存在，锝在溶液中最稳定的是TcO4-,在还原剂和配体存在条件下，锝可与配体以+1, +3, +5等价态形式形成稳定的配合物。在各种还原剂中，亚锡离子是最常用的，所谓锝直接标记法，就是在配体（L）和SnCl2存在条件下，将99mTcO4-淋洗液加入，生成99mTcL配合物。葡庚糖GH可与99mTc形成99mTcO3+核配合物，结构如图1所示。99mTcGH可作为肾显像剂，也可以用于某些肿瘤的鉴别，此外它还可以作为标记中间体，与其它配体进行配体交换反应，生成新的99mTcO3+配合物。图1 99mTcGH99mTc由医用核素发生器制备的得到，放射性核素发生器是一种能从较长半衰期的放射性母体核素中分离出由它衰变而产生的较短半衰期子体核素的一种装置。99Mo - 99mTc发生器是目前临床核医学使用最广泛的、最重要的发生器。99Mo - 99mTc发生器的结构如图31所示。99Mo 以钼酸铵的形式吸附在Al2O3色层柱上，99MoO42-衰变产生99mTc以99mTcO4-形式存在，由于电荷数不同，因此可用生理盐水洗脱99mTc。99Mo99mTc生长衰变关系如下图2所示：图2 99Mo99mTc生长衰变关系99mTc的半衰期为6.02小时，发射能量约为140KeV的g射线，其优良的核性质非常适宜人体显像，目前99mTc制备的放射性药物约占临床诊断药物的80以上。3.放射化学纯度的测定放射化学纯度（radiochemical purity）简称：放化纯度，指在一种放射性核素产品中，以某种特定化学形态存在的这种放射性核素的百分含量。放射化学纯度常用的测定法是色谱法，如：HPLC、TLC、纸色谱法等，其中纸色谱法和薄层色谱法由于简便、快速，成为放射化学最常用的放化纯测定方法。层析装置和层析条如图25，26所示。展开后的层析条可通过放射性探头扫描得到分离曲线，计算不同组分的放射化学纯度，也可采用将层析条均分为10等分，通过g井型探测器（定标器）分别测定各段层析的放射性计数Ii和本底计数Ib，判断Rf值，计算放射化学纯度，例如高锝酸根99mTcO4-在乙腈/聚酰胺层析体系的Rf为0.30.5，99mTcO4-的放射化学纯度计算为：4.小鼠生物分布研究小鼠的品种和品系很多，是实验动物中培育品系最多的动物。在微生物和各种实验研究中，以小白鼠最为普遍，有英国种、法国种、德国种和瑞士种等，而以瑞士种最著名。目前我国各生物制品、医学研究单位繁育的小白鼠为昆明种，该品系为封闭种群，最早在抗日战争时期从缅甸而来，在云南昆明繁殖，经过多年培育繁殖而成，该品系小鼠体型较大，繁殖力强。4.1 小鼠的抓取固定方法：小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤（见图一），将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（图二）。有经验者直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。4.2 小鼠尾静脉注射练习：静脉注射时，用小鼠尾静脉注射架固定（图三），先根据动物大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，固定筒盖即可进行尾静脉注射或尾静脉采血等操作。图三 小鼠尾静脉注射方法 尾静脉注射时，鼠尾静脉在背侧和腹侧各一根，背侧比较容易固定，多采用。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用4550的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张（也可用一米距离外红外灯烤半小时），并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2)号细针头，使针头与静脉平行（小于30），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针，此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射（图四）。图四 小鼠尾静脉注射方法4.3 小鼠的处死：1.脊椎脱臼法右手抓住小鼠用力向后拉，同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头，将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡；如左手拇指与食指放在脊椎第三四节处，鼠下肢瘫痪。2.断头法用左手食指和拇指用力按住小鼠鼠头并将小鼠尾巴缠绕在左手无名指和食指间，用力使小鼠无法动弹，此时小鼠颈部出现勒痕，按此勒痕果断将小鼠头部剪掉。若实验需取血，可在此时用吸管快速将血液转移至容器中。 4.4 小鼠的解剖实验：1.先解剖已处死小鼠的头部，取出完整的脑部；2.用镊子夹住小鼠肚皮上的皮毛，用剪刀剪去皮毛下的腹膜，此时可以看到小鼠腹部的脏器，依次完整的取出肝、胆、脾、肾；3.剪开胸腔与腹腔之间的隔膜，完整的取出胸腔中的肺和心脏；4.最后取出大腿骨，并在大腿上取一块与心脏大小差不多的肌肉。4.5 数据记录与处理数据记录与处理采用生物数据记录表的形式(一只老鼠一个表)，记录表如下：组别： 编号： 1/100ID（百分之一注入计数）脏器W1W2Wn%ID%ID/gW1 : 装脏器的一次性手套手指或小试管的重量。 W2: 装脏器后的总重量。 WW2-W1 n: 脏器的放射性计数 %IDn/百分之一注入计数（）%ID/g = %ID/ W最后在报告或论文中给出配合物在小鼠中的生物分布表以及靶与非靶（T/NT）组织摄取比值表。表3 99mTc-GH在小鼠体内的分布（S, n3 ，ID/g）脏器5min30min60min心肝肺肾脑肌肉血表4 99mTc-GH在小鼠体内肾与其它脏器的XID/g比值 （n=3）脏器5min30min60min 肾/血 肾/肌肉 肾/肺 肾/肝肾/心肾/脑三、仪器与试剂1主要仪器：放射性活度计(中国计量技术开发总公司RM905a),自动定标器(国营二六一厂),井型闪射探头(北京核仪器厂FT-603)，恒温水浴，玻璃注射器，鼠笼，小鼠注射用鼠筒，解剖工具2主要试剂：葡庚糖酸钠，氯化亚锡，盐酸，氢氧化钠，氯化钠，乙腈3主要材料：精密pH试纸，毛细管，聚酰胺薄层层析膜，小白鼠（雌性）四、实验步骤4.1 层析体系的准备（1）生理盐水/聚酰氨（2）乙腈/聚酰氨测定上述体系下99mTcO4-、99mTcO2.xH2O、和99mTcGH的Rf值，以确定99mTcGH的生成，并计算其放化纯度。4.2 试液的配制（1）HCl溶液：1mol/L,0.1mol/L 各50ml （调pH值，稀释Sn(II)用）（2）NaOH溶液：1mol/L,0.1mol/L 各50ml （调pH值用）（3）GH溶液的配制：准确称量GH 100mg，放入干净的青霉素小瓶中，用移液管量取1.0ml蒸馏水溶解。（浓度为10mg/0.1ml）（4）SnCl2溶液的配制：干净的青霉素小瓶中，用移液管量取浓HCl 0.2ml，迅速称量氯化亚锡20-50mg置于小瓶中，待亚锡完全溶解（可水浴加热,加快溶解）后，依亚锡量，用0.1 mol/L HCl将其稀释为5mg/ml，配好后盖上胶塞待用。4.3. 标记条件的研究a)基本标记方法：青霉素小瓶中依次加入配好的葡庚糖溶液和亚锡溶液，精密pH试纸调至所需pH，然后加入Tc-99m淋洗液约0.1-0.2mCi/0.1ml，加上胶塞后摇匀，放置一定时间，测定99mTcGH放化纯度。b)标记条件的研究: 通过考查亚锡含量、pH值、温度和反应时间对99mTcGH放化纯度的影响，确定最佳标记条件。（a）亚锡量的影响：GH:10mg, pH:7-8, 室温反应10min 编号12