黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响.doc

黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响试验设计试验材料：试验动物：健康BALB/c小鼠60只，雌性，6-8周龄，体重18-22g。小鼠随机分成6组：正常对照组、模型组、地塞米松阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组。试验试剂：黄芩苷、卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶、地塞米松、小鼠TL-4、IL-5、. 1L-13、IL-17、IFN-细胞因子和小鼠抗OVA-IgE ELISA试剂盒、脂多糖（LPS）、过碘酸雪夫反应试剂盒、RT-PCR试剂盒、乙酰甲胆碱等主要仪器：试验方法：建模： 嗜酸性粒细胞性哮喘模型 模型组、阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组小鼠分别于第1、7、15天腹腔注射OVA溶液0.2mL(含OVA20、氢氧化铝1),于实验第21天起将小鼠置于密闭容器内,予2%OVA生理盐水雾化激发,1次/天,每次30min,连续7,以呼吸急促深快、烦躁呛咳及点头运动等症状的出现为激发成功;正常对照组:于第1、7、15天以生理盐水代替OVA溶液给小鼠腹腔注射(0.2),第21天起以生理盐水进行雾化激发。其余同前。 中性粒细胞性哮喘模型 小鼠致敏：于实验第1天、7天和15天分别致敏，共三次。方法：每只小鼠用 1%戊巴比妥钠溶液 50mg/kg 腹腔内注射麻醉后，使其颈部竖直，用移液器取 10g LPS 经鼻逐滴滴入，利用小鼠呼吸将致敏液吸入气道，左右鼻孔交替进行并于腹腔内注入 OVA 50g。 小鼠激发：从实验第 21 天起，将哮喘组小鼠置于自制小鼠雾化吸入箱中，用 5%OVA溶液进行雾化吸入激发，每天雾化 30min，连续雾化2周给药方法：自实验第21天起,在OVA溶液雾化攻击前1给予相应药物。黄芩苷高、中、低剂量组分别灌胃给予黄芩苷90、30、10mg/kg (灌胃容积25ml/kg);阳性对照组小鼠灌胃给予地塞米松1.0mg/kg;正常对照组、模型组小鼠灌胃等容积生理盐水,连续7(于第28天,即末次激发后24处死小鼠)。标本收集：小鼠血清：末次激发后24 h,小鼠经眼球采血。全血37静置2 h,4过夜,3 000 rpm离心l0min。收集血清样本,用于测定血清中抗OVA特异性IgE表达水平。肺泡支气管灌洗液：末次激发后24 h,将小鼠麻醉腹部向上固定于蛙板,剪开皮肤,剥离气管,用眼科剪将气管剪适中小口,用磨平的15号针头做气管插管,将线绳穿过气管底部,固定气管与针头。将0.5mL37生理盐水缓慢注入其中,轻轻按压胸部,然后回收置于离心管中,重复2次,使其回收率达80%。合并3次灌洗液。BALF中细胞因子测定：将 BALF 1 500 rpm 离心10 min,取上清液测定BALF中 IL-4、IL-5 、IL-13、IL-17、IFN-表达水平。按ELISA试剂盒说明书进行测定。BALF中炎性细胞总数和分类计数：将BALF离心后细胞泥悬浮于1mL PBS,吸取20L涂片、干燥、固定,进行瑞士-姬姆萨染色,每板至少200个细胞。根据形态学特征进行分类计数,炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)、中性粒细胞（NEU）和巨噬细胞。肺病理组织切片的制作:末次激发后24 h,小鼠眼球放血处死,剪 小鼠皮肤,剖开胸腔,取出肺脏。将小鼠肺脏浸入10%福尔马林固定,修整组织块,常规石蜡包埋切片,进行HE染色,镜检观察。过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色观察黄芩苷作用后,哮喘模型小鼠肺部病理学变化。RT-PCR:引物设计及合成-,上游,5-3,下游,5-3,扩增产物136;-3,5-3,下游,5-3,扩增产物408;-6,上游,5-3,下游,5-3,扩增产物361;-,上游,5-3,下游,5-3,扩增产物491。趋化因子：Th1：CXCR3、CCR5 Th2：CCR3、CCR4、CCR8气道阻力、AHR测定:于雾化第1、7、14天釆用Buxco小鼠肺功能仪(Fine PointeTM SeriesRC Site)检测小鼠总气道阻力。l%OVA雾化完毕后立即予1%戊巴比妥钠60mg/kg麻醉小鼠,切开皮肤,钝性分离皮下组织、肌肉,充分暴露气管,眼科剪剪开一个小口,取18G Buxco小鼠气管插管置入气管中行有创气管插管术;预热加热板至37,连接小鼠肺功能测量仪,将小鼠置于密体描恒温箱加热板上,呼吸机辅助呼吸,呼吸频率140次/min,潮气量0.25ml,先测定小鼠基础肺阻力(一般小鼠的基础肺阻力为0.8-1.5),1分钟后如基础肺阻力平稳,依次雾化l0ulPBS及l0ul倍增浓度的乙酰甲胆碱,浓度依次为 3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL 50mg/mL,检测气道阻力R (cm H2O s/ml)的变化。以吸入PBS时的气道阻力为R(baseline),吸入各不同浓度乙酰甲胆碱的气道阻力为各浓度的R(response),取每个浓度总气道阻力的最高值,按以下公式换算成与PBS激发时的比值增加的倍数(fold increase)作为评价AHR的指标。fold increase of R = R(response) - R(baseline)/R(baseline)气道炎症相关信号通路调节作用： 取小鼠肺组织，提取浆蛋白、核蛋白和总蛋白，Western Blot提取蛋白，蛋白含量测定，SDS-PAGE（电泳，转膜，免疫反应），凝胶图像阳性对照组、空白组、模型组、高中低剂量组、marker、内参统计学处理 应用SPSS进行处理,各组间比较采用单因素方差分析。脾单个核细胞制备和培养取BALB/c小鼠,脱颈法处死,放75%酒精中全身浸泡10分钟消毒,以预冷4-8、PH7.2的PBS冲洗2次。(2)在60mm培养皿中放入4-5mL PBS液,在无菌钢网(200目)内研磨成细胞悬液,使得分散的单细胞透过钢网进入PBS液中。尼龙筛过滤细胞悬液,去除细胞团及未研碎的细胞块。(3)1500rmp/min,离心10min,完全抽取上清液。用5mLPBS重悬沉淀细胞。(4)将装有5mL小鼠淋巴细胞分离液的离心管倾斜,在液面上方1cm处沿管壁缓慢注入细胞悬液,避免细胞悬液与淋巴细胞分层液混合,2000rmp/min,离心20 min。(5)离心后分为四层,吸出第二层即淋巴细胞层,加入8mL PBS液,充分混勾后,1500rmp/min,离心10 min。(6)完全抽取上清液,沉淀经反复洗涤2次即得所需细胞。(7)常规胎盼蓝染色确定细胞存活率,计数。阴性分选CD4+T细胞(1)确定细胞数量,1500rmp/min离心10min,完全抽取上清液。(2)配备缓冲液,PBS(PH7.2,4-8),配以0.5%胎牛血清及 2mmol/L EDTA。每107细胞用40uL缓冲液悬浮,每107细胞加10uL Antibody Cocktail,充分混勾,4-8避光孵育10min。(3)每107细胞加 30uL 缓冲液,20uL Anti-Biotin MicroBeads 及 10uLCD25-PE抗体,充分混匀并4-8避光孵育15min。(4)每107细胞加入l-2mL缓冲液,充分混匀,1500rmp/min离心10min。完全抽取上清液。(5)用500uL缓冲液悬浮细胞,充分混匀(500ul最多可1.25108,如果细胞数量多,相应扩大缓冲液倍数)。(6)Midi-Magnetic分离器置于MACS Multistand 中,