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医学生物学克隆论文 克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群下面是我整理的关于医学生物学克隆论文仅供参考 1结果与分析 1.1小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以小桐子叶片材料提取总RNA并反转录cDNA为模板扩增JcMSRA基因cDNA全长序列结果表明扩增得到的产物约0.9kb(图1A)将目的条带切胶回收后与T/A克隆载体pEASYT1连接转化大肠杆菌菌落PCR验证阳性克隆(图1B)挑取阳性克隆过夜摇菌提取重组质粒pEASYT1JcMSRA(图1C)并以M13通用引物进行测序 1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析经测序分析本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全长879bp包含一个完整的开放阅读框(780bp)编码259个氨基酸(图2)通过将JcMSRA编码框与其基因组序列(Jcr4S03665,1464816350位,1702bp)比对发现JcMSRA基因包含2个外显子(长度分别为528bp与252bp)与1个内含子且内含子的序列(924bp)较2个外显子都长符合AT/GT的剪切规则ProtParam分析结果显示JcMSRA编码的蛋白质分子量为29.1kD理论等电点为8.75且单体亚基不稳定说明其属于多聚体蛋白质 另外该蛋白质N端不含信号肽预测其亚细胞定位可能性最大的为线粒体、其次为细胞核ExPASy的COILS预测发现该蛋白质在190220位有一个明显的卷曲螺旋区域(图3A)作为一种超二级结构卷曲螺旋一般由27个短的琢螺旋组成是许多转录因子与功能蛋白质的结构元件该卷曲螺旋出现的位置正好是其二级结构中琢螺旋最长的部位与SOPM服务器预测的结构吻合(图3B)分别以大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果杨(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)与小桐子MSRA氨基酸序列进行多重序列比对(图4)发现MSRA氨基酸序列在N端与C端都没有同源性差异变化较大而在中部相对保守 MSRA属于单结构域蛋白位于该酶蛋白活性中心的核心氨基酸残基为Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(图4,菱形标注)而GCFW保守序列的Cys与C端的两个保守Cys残基主要起维持酶活性中心结构的功能将小桐子MSRA氨基酸序列进一步与MSR家族的三类不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列进行多重序列比对并构建系统进化树(图5)由图中可以看出不同的MSR被聚类为明显的三条分支印证了MSR三个家族在氨基酸一级序列及高级结构等方面的进化差异性我们得到的小桐子MSR被归入了MSRA分支中与小桐子的近科物种毛果杨(Populustrichocarpa)在进化上距离较远序列相似性仅为22.19%而与芸豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的亲缘关系较近序列相似性分别为70.30%、68.82%、61.65%、60%目前通过X晶体射线衍射法已经获得了几种(如大肠杆菌,毛果杨,牛)MSRA的高分辨率三维结构我们通过同源建模方法构建了小桐子MSRA的三维空间结构并进行了氨基酸残基能量评估(图6)综合研究MSRA的晶体结构显示其表面都有一个口袋状结构且该结构周围的氨基酸残基相对保守后被证实是底物甲硫氨酸亚砜的结合位点小桐子MSRA蛋白的底物结合位点氨基酸构成为Tyr132、Glu144、Tyr184另外GCFW保守序列中的最后两位氨基酸Phe102、Trp103也参与了催化中心的形成(图6A)而GCFW保守序列结构域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在维持结合位点空间结构方面也是不可或缺的 Ramachandram能量图分析显示有96.9%的氨基酸残基处于能量稳定区域说明预测的三维结构可信(图6B)小桐子MSRA空间结构核心区域是3段琢螺旋包裹的6条茁折叠片层结构呈现琢/茁卷状二级结构组成顺序以茁1琢1茁2茁3琢2茁4琢3茁5茁6排列并且茁1与茁6较短而核心4条茁折叠较长在拓扑结构上排列为反平行方式另外在茁2与茁3之间有1段极短的琢螺旋在琢2与茁4之间存在2条反平行的极短茁折叠与1段极短琢螺旋而在靠近N末端还存在1段极短琢螺旋C端存在2段极短琢螺旋蛋白质核心区域被两端柔性区包裹包括N端的92个氨基酸残基(Met1Glu92)与C端的33个氨基酸残基(Ala227Gly259) 2讨论 甲硫氨酸亚砜还原酶作为生物体内的抗氧化修复因子属于多基因家族目前已经报道的甲硫氨酸亚砜还原酶有三个亚家族不同家族虽然催化相似的反应但没有一级氨基酸序列及三维结构相似性(Rouhieretal.,)最早被报道的两个亚家族是MSRA与MSRBMSRA与MSRB能够分别特异性地还原MetSSO与MetRSO且两者既可以催化游离的甲硫氨酸亚砜也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亚砜第三个MSR家族最早在大肠杆菌中发现命名为fRMSR(freemethionineRsulfoxidereductase)而该酶只能催化游离的甲硫氨酸亚砜 MSRA最早从大肠杆菌中分离出来的是一类相对较小的胞质酶编码该酶蛋白的基因广泛存在于生物界如梭状芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金属还原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜热古生菌(T.kodakaraensis)、酵母菌、拟南芥、杨树、果蝇、小鼠、大鼠及人该亚家族不同种属间同源性不高但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的在N端存在一个保守序列GCFWG(尤其是中心的Cys)这一序列的突变将导致MSRA完全失活；另外在C端存在两个保守的还原型Cys残基以上三个保守的Cys在空间结构上共同参与MSRA催化中心的构成(Rouhieretal.,)MSRB最初也是从大肠杆菌中发现的且在黄单孢菌(Xanthomonascampestris)、梭状芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、拟南芥、烟草、果蝇及人等生物体中都存在属多基因亚家族在不同生物体(如人,小鼠等)中一般都有3个MSRB主要定位于内质网与线粒体其N端定位信号肽在不同的MSRB中较为保守MSRB在其N端同样存在GCGWP保守序列除此之外大部分MSRB在其C端仅存在一个保守的Cys残基(Dingetal.,)与MSRA不同MSRB中还包含两个CXXC保守序列用于结合Zn2+或Fe2+共同构成MSRB的活性中心(Olryetal.,) 目前关于MSRA与MSRB的表达、调控及作用机理的研究主要集中在微生物及动物中如大肠杆菌、酵母菌、小鼠及人等而对于植物MSR的研究报道近几年才逐渐增多本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是首次报道研究发现拟南芥中至少存在5个编码不同形式的MSRA基因AtMSRA1AtMSRA5同时存在至少9个MSRB基因AtMSRB1AtMSRB9；另外在毛白杨中发现9个MSR基因包括5个MSRA与4个MSRB；在水稻中发现4个MSRA与3个MSRB基因利用在线软件预测发现不同的MSR在植物细胞中有不同的定位目前发现的包括细胞质、叶绿体、线粒体、内质网及分泌型MSR等(Rouhieretal.,)芯片数据与转录组数据都表明不同亚细胞定位的MSR有着不同的组织表达模式胞质型MSR通常在所有组织器官中都有表达叶绿体型MSR主要在绿色组织尤其是叶中表达 Romero等()通过RTPCR分析了拟南芥不同MSR类型的组织表达特异性结果表明AtMRA4在除根以外的所有组织中的表达量都很丰富其总表达量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表达量仅次于AtMSRA4且主要在根和茎中表达；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有组织中的表达量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表达量在叶和其它绿色部位中最高而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMSRB8、AtMSRB9则主要在根中高表达大量数据表明各种生物与非生物胁迫可以诱导高等植物不同MSR基因的表达强光与盐胁迫可以强烈诱导拟南芥质体型AtMSRA4的表达(Gustavssonetal.,)定位在内质网中的AtMSRB3可清除在植物受冷胁迫时内质网中积累的MetSO和ROS过表达AtMSRB3可以提高拟南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,)而水稻OsMSRB1.1在受到包括盐、甘露醇、低温、甲基紫精和ABA在内的非生物胁迫时表达量上升而高温处理则会使OsMSRB1.1表达量下降(Guoetal.,)以上事实说明MSR基因表达种类的多样性与组织特异性、表达调控的复杂性以及与植物应答逆境胁迫的关联性同时也暗示其在植物抗逆性研究中的应用前景 3材料与方法 3.1实验材料及处理供试小桐子种子采自云南省楚雄州元谋县选取饱满的小桐子种子用1.5%CuSO4消毒20min无菌水漂洗5次于26的恒温培养箱中吸涨24h(李忠光和龚明,)将吸涨的种子在无菌水中漂洗3次播于垫有5层用无菌水湿润滤纸的白磁盘(24cm伊16cm)中于相对湿度75%、昼夜温度26/20、光周期16/8h的恒温培养箱中萌发5d之后将发芽的种子播于消毒的培养土中并于同样恒温培养箱中培养15d至第二片真叶展开取第二片真叶材料液氮速冻后置于80冰箱中用于RNA的提取 3.2菌株与主要试剂大肠杆菌Trans1T1(DH5琢)菌株由本实验室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPolymerase、Amp、Xgal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwoStepRTPCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMiniPrepKit、pEASYT1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker购自全式金生物技术有限公司；引物合成和测序由深圳华大基因有限公司完成 3.3实验方法 3.3.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成取0.2g小桐子叶片材料按照王海波等()的方法利用TransZolUp试剂提取并纯化总RNA以AnchedOli(dT)18为逆转录引物利用TransScriptTwoStepRTPCRSuperMix合成第一链cDNA 3.3.2小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以拟南芥MSRA全长mRNA序列(XM002510827.1)为种子序列对我们高通量测序得到的小桐子低温锻炼转录组(GenBank登录号:GAHK00000000.1)的45251条Unigenes进行本地Blast得到小桐子MSRA基因的序列Unigene850JCCK1A(GAHK01013398,1714bp)序列分析表明其包含全长F(780bp)以此序列为基础设计全长cDNA克隆引物并送深圳华大基因合成引物序列为：上游F(5ACACAACTTAACTCAACACGTCA3)；下游R(5AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC3)以3.3.1中反转录cDNA模板使用TransStartTaqDNAPolymerase进行PCR扩增扩增条件为：945min寅9430s,54.930s,721min35寅7220min扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物利用EasyPureQuickGelExtractionKit从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段(879bp)并与克隆载体pEASYT1连接转化大肠杆菌Trans1T1感受态细胞涂LB抗性平板(LBAmp垣IPTG垣Xgal)过夜生长挑取白斑菌落进行菌落PCR鉴定阳性克隆取名为pEASYT1JcMSRA并送深圳华大公司利用pEASYT1质粒上的M13F与M13R通用引物进行双向测序 3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析利用Spidey软件进行克隆cDNA序列与基因组序列比对以确定JcMSRA基因内含子与外显子的结构利用BioEdit软件将JcMSRAcDNA序列翻译成氨基酸序列利用在线工具ProtParam计算蛋白质的理论分子量、等电点等基本参数利用WolfSpt在线软件对蛋白质