《基因克隆的载体》PPT课件.ppt

第四章基因克隆的载体 载体基本条件 自我复制限制性内切酶位点筛选标记克隆载体 表达载体表达载体含有启动子和终止序列 第一节质粒载体第二节 噬菌体载体第三节粘质粒载体第四节M13噬菌体载体及噬菌粒第五节真核细胞用载体第六节人工染色体 第一节质粒载体 1 一般特性双链闭合环状松弛型质粒 严紧型质粒氯霉素 壮观霉素ColE1复制起点质粒的复制调控质粒的不相容性利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象 带pMBI 或ColE1 复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小 质粒不亲和现象图解 2 比较pBR322和pUC18 19pBR322质粒限制性内切酶图谱 pUC18 19质粒的限制性内切酶图谱 pUC18 19质粒的多克隆位点 多克隆位点筛选标记 互补拷贝数分子量 乳糖操纵子模型 IPTG非代谢诱导物Xgal 无色 半乳糖苷酶半乳糖 5 溴 4 氯靛蓝 深蓝色 半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法质粒编码 半乳糖苷酶氨基末端 肽段 宿主细胞编码缺陷型 半乳糖苷酶 失去正常的氨基末端 单独都不能产生有活性的 半乳糖苷酶两者结合在一起 才能形成有功能的 半乳糖苷酶 互补 lacZ 内 具有一段多克隆位点序列 MCS 在正常情况下 插入到MCS的外源DNA片段 都会阻断 肽链的合成 因此含有重组质粒载体的克隆是无色的 它可以与含有非重组质粒载体的克隆形成的蓝色 背景 明显地区别开来 3 比较pGEM和pUC18 19 含有噬菌体的启动子 可合成RNA用途 杂交探针体外翻译体外剪切反应 4 T载体pMD18 TVector高效克隆PCR产物 TACloning 的专用载体 由pUC18载体改建而成在pUC18载体的MCS位点处的Xbal和Sal识别位点之间插入EcoRV识别位点 用EcoRV进行酶切反应后 再在两侧的3 端添加 T 而成 大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3 末端添加一个 A 的特性 5 E Coli的表达载体表达载体和克隆载体的主要区别 强启动子和终止序列E Coli SD序列 真核生物基因在原核生物E Coli中表达转录翻译翻译后修饰 诱导表达和分泌表达PBV221限制性内切酶图谱 30 42 信号肽一般特征 含13 26个氨基酸残基 在或靠近其N端有一至多个带正电荷的氨基酸 在中部为由10 15个氨基酸 大部或全部是疏水性的 组成的疏水核pTA1529质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列 第二节 噬菌体载体 1 噬菌体的特性48 5Kb线性双链DNA在病毒颗粒内线性 两端单链互补被称作cos末端 cosend 一旦进入细胞 两个cos末端就会迅速相互结合 形成有缺口的环状基因组 细胞的DNA连接酶可以修补该缺口 溶源寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂 不产生子代噬菌体颗粒溶菌寄主细胞因裂解而致死 释放出许多噬菌体颗粒 DNA限制图谱 2 Charon系列载体构建基因组文库Charon28的限制性酶切位点 5 24Kb 3 EMBL系列载体构建基因组文库Mbo BamH Bgl Bcl Xho Sal EcoR EMBL3和EMBL4的限制性酶切位点 23Kb 4 gt系列载体构建cDNA文库 6 8 2Kb 表达 gt11载体的限制性酶切位点 利用特异性抗体作为探针筛选 gt11表达文库 插入位点位于LacZ基因的C末端 可作为 半乳糖苷酶融合蛋白表达 可用抗体探针筛选蓝白斑筛选温度敏感诱导表达裂解基因中的琥珀突变 UAG琥珀型amberUAA赭石型ochreUGA乳白型opal无义突变 nonsense 使蛋白质长度提前终止 引起多肽长度变化抑制基因编码生成突变的tRNA 反密码子突变或其它位置突变 识别无义密码子 但携带氨基酸 某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥珀突变抑制基因SupE在UAG密码子的位置上加上谷氨酰胺SupF在UAG密码子的位置上加上酪氨酸注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替 大容量减少构建和筛选的重组克隆数多轮筛选 噬菌体载体容量有限当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型 噬菌体基因组的105 或小于野生型 噬菌体基因组的78 时 其存活力剧降 第三节粘质粒载体 柯斯质粒载体 35 45Kb cossite carringplasmid带有粘性末端位点 cos 的质粒 使用双cos位点载体c2RB进行的粘质粒克隆 第四节M13噬菌体载体及噬菌粒 1 M13噬菌体的特征M13 f1和fd长度为6 4Kb 单链环状DNA分子 正义DNA基因组 仅有的病毒基因组90 以上都编码蛋白质 10个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔 仅有两个较长的基因间隔区 复制RF200个拷贝 细胞1000个子代噬菌体颗粒 每个细胞每个世代 2 M13噬菌体载体丝状噬菌体的所有基因均为必需基因 外源基因放在哪里 基因间隔区基因 与基因 基因 与基因 重组操作双链DNA单链DNA可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究 M13mp18和M13mp19载体的限制酶切图 主要不足之处 易产生外源DNA片段的部分缺失 且外源DNA越大其缺失频率越高 一般情况下其有效的最大克隆能力仅1500bp 3 噬菌粒 phagemid 带有丝状噬菌体复制起点的质粒可容纳较长的外源DNA片段 约10Kb 在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区 噬菌粒图解及克隆位点 超感染 如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基因组 噬菌粒中含有来自野生型M13DNA的基因间隔区辅助噬菌体 M13K07 基因组中带有来自M13载体的基因间隔区 第五节真核细胞用载体 穿梭载体 shuttlevectors 在原核细胞中复制扩增 在真核细胞中扩增 表达 基本条件 原核基因的复制其始序列和筛选标记 真核基因的复制其始序列和筛选标记 启动子序列 转录终止和polyA加入的信号序列 限制性内切酶位点 通用的酵母表达载体 重组体借助Aox1的5 及3 区序列整合入宿主细胞两种典型的酵母 Pichia 表达载体pPIC3和pPIC3K 第六节人工染色体 1 YAC 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome 在酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系 由酵母染色体中分离出来的DNA复制其始序列 ARS 自主复制序列 着丝点 端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体 主要缺点 易出现嵌合体不稳定不容易与酵母自身染色体相分离2 B