高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中马来酸和水杨酸.pdf

2 0 1 0年 5月 第 3期 南 京 晓 庄 学 院 学 报 J OURN AL OF NAN J I NG X I AOZ HUANG UNI VE RS I T Y Ma v 2 01 0 No 3 高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中马来酸和水杨酸 周红霞 张凤 许蔚 杨雯筌 柳 菡 徐锦忠 1 南京晓庄学院 生物化工与环境工程学院 江苏 南京 2 1 1 1 7 1 2 江苏省出入境检验检疫局食品实验室 江苏 南京 2 1 0 0 0 1 摘要 建立 了蜂 蜜中的马来酸和水杨酸的高效液相 色谱 串联质谱 的检测方法 采用 V A R I A N C 1 8 E t h e r 色谱柱 1 5 0 2 m m 5 m 检测 以甲酸和甲醇为流动相 流速 2 5 0 L mi n 结果 在 0 2 m g L 一5 0 m g L 范围内 马来酸和水杨酸浓度与峰 面积呈 良好的线性关 系 R 0 9 9 0 0 在 5 0 g k g 1 0 0 g k g 2 0 0 I x g k g 三个添加水平下 马来酸和 水杨酸的平均回收率范 围 为 8 O i 3 0 定量限为 2 0 g 该方法简便 快速 灵敏 准确 关键词 高效液相 色谱 串联质谱 法 蜂蜜 马来酸 水杨酸 中图分类号 T S 2 0 7 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 9 7 9 0 2 2 0 1 0 0 3 0 0 5 7 0 4 马来酸用来制取农药马拉松 达净松 富马酸 不饱和聚酯树脂 染色助剂以及油脂防腐剂等 吸人 摄人 或经皮肤吸收后对身体有害 对眼睛 皮肤 粘膜有强烈 的刺激作用 吸人后可引起喉 支气管的痉挛 炎症 水肿 化学性肺炎或肺水肿 接触后可引起烧灼感 咳嗽 喘息 喉炎 气短 头痛 恶心和呕吐 对环境有危害 对大气可造成污染 水杨酸是重要的精细化工 原料 在医药工业中 水杨酸本身就是一种用途极广的消毒防腐剂 因此 有机酸的定性与定量分析不仅 对食品营养学研究意义重大 而且在食品生产过程的质量管理 中也必不可少 由于蜂蜜中本身含有多中有机 酸 而不同种类的蜂蜜所含的有机酸比例也不同 因此检测蜂蜜中的有机酸有助于鉴别真假蜂蜜 目前 用于有机酸分析的方法很多 滴定法一般只用于食品中总酸度的测定 比色法 荧光 薄层色谱法 气相色谱 法 分光法 酶法等方法虽说仍用于有机酸的分析 但这些方法一般要进行预分离 衍生化等繁琐的前处理 而且能达到同时分离有机酸种类较少 吲 H P L C分析有机酸不仅简便快速 而且选择性好 准确度高 H P L C 的分离模式与检测方法多种多样 可 以根据样品的构成与性质来选 择合适的色谱条件 色谱柱 淋洗液 检 测器等 有关上述两种有机酸的分析测定 国内外 已经有报道 但多数是用高效液相色谱或反相高效液相 色谱法 叫 本实验采用高效液相色谱串联质谱法 H P L C MS MS 测定蜂蜜中马来酸和水杨酸的含量 实验 结果表明 该方法简便 灵敏 线性范围宽 可以用于蜂蜜样品的测定 1 材料 与方法 1 1 材料与试剂 甲醇 色谱纯 甲酸 色谱纯 马来酸标准品 水杨酸标准品 D r E h r e n s t o r f e r 公 司 1 2 主要仪器与设备 Wa t e r s WA X固相萃取柱 液质联用仪 由S u r v e y o r 液相色谱系统和T h e r m o F i n n ig e n Q u a n t u m U l tr a 三重 四极杆 串联质谱一 电喷雾电离源 E S I 一 构成 真空氮气吹干仪 Z y m a r k公司 U S A 收稿 日期 2 0 1 0 0 3 1 2 修 回 日期 2 0 1 0 04 2 0 基金项目 国家十一五科技支撑计划项目N o 2 0 0 6 B A J 0 2 A 0 8 6 资助 作者简介 周红霞 1 9 7 6 一 女 江苏淮安人 博士 南京晓庄学院生物化工与环境工程学院副教授 研究方为食品检验检疫 通讯作者 徐锦忠 1 9 7 2 男 江苏高邮人 博士 江苏省出入境检验检疫局食品实验室高级工程师 研究方向为食品各 种残留分析 E m a i l x u j z j s c i q g o v c n 一 5 7 1 3 样品提取及净化 准确称取蜂蜜试样 1 0 0 0 0 5 g 置于 5 0 m L玻璃离心管中 加人 5 m L水 于涡旋器上快速混合 1 m i n 加入 1 0 mL乙腈涡旋提取 超声 1 0 m i n 2 0 0 0 r mi n 离心 5 m i n 取上清液于 5 0 m L玻璃管中 分别用 3 mL甲醇和 3 m L水活化 Wa t e r s WA X固相萃取柱 然后将提取液过柱 溶液以 2 m L mi n 的流速通过柱 子 待溶液完全流出后 用 5 m L 2 甲酸和 5 m L水洗柱子 抽干 最后再用 5 mL 5 氨水 甲醇洗脱 接收 洗 脱液于5 0 下用氮气吹干仪吹干 定容至 1 0 m L 过 0 4 5 m的滤膜到进样瓶 中 供 H P L C MS M S测定 1 4 试验条件 1 4 1 色谱条件 色谱柱 V A R I A N C 1 8 E t h e r 色谱柱 1 5 0 2 0 m m 5 m 流动相 甲醇 A 0 1 甲酸水溶液 B 流 速 0 2 5 m L m i n 柱温 室温 进样量 2 5 L I 1 4 2 质谱 M S MS 条件 电喷雾离子源 负离子扫描 选择反应监测 喷雾电压 4 6 0 0 V 鞘气压力 3 0 a r b 辅助气压 5 a r b 毛细管 温度 3 2 0 2 结果与分 析 2 1 样品提取和净化 2 1 1 提取 用乙腈提取 可以去除蜂蜜 中的蛋 白质 胶质物等大分子物质 且过柱流畅 2 1 2 净化 由于马来酸和水杨酸含羧酸基团 固相萃取时 使用了Wa t e r s O a s i s WA X固相萃取小柱 它是混合型弱 阴离子交换反相吸附剂 对强酸性化合物具有高的选择性和灵敏度 用 甲酸清洗柱子回收率可达到 8 0 2 2 马来酸和水杨酸的色谱 图及质谱图 马来酸和水杨酸含羧酸基团 在负离子扫描条件下 可形成 M H 一 离子 实验中选择的母离子 Q 1 子 离子 Q 3 离子对及其碰撞能量见表 1 表 1 马来酸和水杨酸的选择监控离子及碰撞能量 8 0 6 0 马来酸和水杨酸的分离色谱图和质谱 图如图 1 和图 2所示 R T 0 0 0 1 2 0 0 S M 5 B al RT 3 0 0 m z 7 0 95 ES I S RM 琢 r 71 0 4 4 71 1 1 1 5 01 5 1 1 G e s i s 5 O NL 6 9 4E m z 9 2 97 ES I s J M 9 3 0 61 9 3 l 36 9 9 5 1 1 G n c s i s 5 0 l 一 5 8 一 T ime ra i n b 1 图 1 t 0 0 8 0 A A 7 7 8 8 3 4 0 NL l 0 5 ES I S RM 9 3 0 6 1 5 l 3 6 9 9 5 G nc s i s n 0 2 4 6 8 l 0 1 2 T imc m i n 1 b 2 标准和蜂蜜样品中的马来酸 a l a 2 水杨酸 b l b 2 的分离色谱图 加 u 0 q 雪 0 毫 一 H 鲫 柏 加 8曩 d口 0 A l 苗一 1 o o 9 5 9 O 8 8 5 鲮 3 5 3 O 2 5 2 O 1 5 1 0 0 5 0 0 n g mL 3 5 4 2 4 0 4 3 RT 2 8 9 3 3 0 AV 1 0 0 NL 7 1 2 E5 F 一 C E S I S R M m s 21 I 5 0 2 0 7 1 0 4 4 7 1 0 5 4 1 1 5 0 1 5 1 1 5 0 2 5 器 9 0 豁 8 7 5 g 7 0 暑 6 5 主翼 5 0 专 45 3 4 5 0 3 0 1 5 2 0 7 1 O 4 5 71 0 5 0 l l 5 O1 5 r r VZ a 5 0 0 n g mL 1 1 1 5 4 1 1 3 9 5 RT 9 0 9 9 2 9 AV 4 9 NL 6 4 9E 6 F c E S I S R M m s 21 3 7 0 0 0 9 3 0 6 1 9 3 0 7 1 1 3 6 9 9 5 1 3 7 0 0 5 0 0 1 3 7 0 0 9 5 9 0 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 O 5 5 5 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 2O 1 5 1 O 5 O I 1 5 0 2 0 l l 5 0 2 5 9 3 0 6 5 m z m z 图2 马来酸和水杨酸标准溶液的质谱图 ma t r ix b l a n k 3 5 3 4 3 8 3 7 RT 2 8 8 3 l 3 A V 6 l NL 4 5 3 E 4 F C ES I S RMms 2 1 1 5 0 2 0 7 1 0 4 4 7l 0 5 4 1 1 5 01 5 1 1 5 0 2 5 l 5 0 2 7 1 O 4 5 7 1 0 5 0 l 1 5 0 l 5 a 1 1 5 0 2 0 1 l 5 0 2 5 m z 9 3 0 7 0 1 3 6 9 9 5 b 1 3 7 0 0 0 1 1 q z 5 0 0 ri g mL 1 1 1 5 4 1 1 3 9 5 R T 9 0 9 9 2 9 A V 4 9 NL 6 4 9 E 6 F cE S I S R M ms 2 i 3 7 0 0 0 9 3 0 6 1 9 3 0 71 l 3 6 9 9 5 一 l 3 7 0 0 5 1 0 0 9 5 9 0 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 0 5 5 5 0 4 5 4 0 3 5 3 0 2 5 2 O l 5 1 0 5 O 9 3 0 6 5 图3马来酸和水杨 酸基质样 品的质谱图 m z l 3 7 0 O 9 3 0 7 0 1 3 6 9 9 5 b l 3 7 0 0 0 由图 1和图3可知 基 质样品 中有少量 的马来酸检 出 但 是强度很低 且离子碎片 的丰度 比 1 0 一 1 5 与标准溶液中马来酸的离子碎 片丰度 比不 同 2 0 2 5 可 以忽略 蜂蜜本身含有水杨酸 因此检 出的水杨酸强度可达到 1 0 5 E 6 且离子碎片的丰度 比与标准溶液 中马来酸的离子碎片丰度 比相仿 6 5 7 0 2 3 方法灵敏度 定量限 L O Q 用马来酸和水杨酸浓度为 2 O n g m L 5 0 n g mL 1 0 0 n g mL 一 2 0 0 n g mL 5 0 0 n g m L 的混合标 准溶液进样 测得的峰面积 Y 与浓度 X mg 1 一 绘制标准 曲线 进行 回归分析 线性方程 相关 系数 检出 限和定量限如表 2所示 从结果可以看出线性相关系数都大于 0 9 9 相关性很好 表2 线性方程 相关系数 检出限 L OD 和定量限 L OQ 2 4 回收率和精密度 选择蜂蜜做为基质 在 5 0 g k g 一 1 0 0 g k g 一 2 0 0 g k g 三个添加水平进行三批加标回收实验 每批有 5 组平行样 其平均回收率及日内精密度 R S D 日间精密度 R S D 见表 3 一 59 一 D 熹 p u I 一 0 u 蠹 口 口 j I苗 表3 蜂蜜在三个添加水平下的平均回收率 R n 5 日内精密度 R S D n 5 日间精密度 R S D n 3 由表 3结果显示在 5 0 g k g 1 0 0 g k g 2 0 0 1 x g k g三个添加水平下 马来酸的回收率在 1 1 0 一1 3 0 之间 日内精密度 R S D 8 9 9 日间精密度 R S D 1 1 4 6 水杨酸的回收率在 7 5 1 1 5 之 间 日内精密度 R S D 1 0 7 5 日间精密度 R S D 2 1 4 5 5 完全满足 日常分析检测 的需要 参考文献 1 D a n B y l u n d S a r a H N o r s t o r m S o fi a A e t a1 A n a l y s i s o f l o w m o l e c u l a r ma s s o r g a n i c a c i d s i n n a t u r al w a t e r s b y i o n e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y J J o u r n al o f C h rom a t o g r a p h y A 1 1 7 6 2 0 0 7 8 9 9 3 2 J a a n a K a k o l a R a i m o A l e n A f a s t me t h o d f o r d e t e r m i n i n g l o w m o l e c u l a r m a s s a l i p h a t i c a c i d s b y h i g h p e rf o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a t m o s p h e ri c p r e s s u r e c h e m i c al i o n i z a t i o n m a s s s p e c t r o m e t ry J O r i g i n a l P a p e r 2 0 0 6 2 9 1 9 9 6 2 0 0 3 3 L i h u Y a o a Y u e mi n g J i a n g R i a n t o n g S i n g a n u s o n g e t a 1 P h e n o l i c a c i d s i n A u s t r a l i a n M e l al e u c a G u i o a L o p h o s t e m o n B ank s i a a n d He l i a n t h u s h o n e y s a n d t h e i r p o t e n t i a l for fl o r al a u t h e n t i c a t i o n J F o o d R e s e arc h I n t e rna t i o n a1 3 8 2 0 0 5 6 5 1 6 5 8 4 K a f k a s E K o s a r M T u r e m i s N e t a1 A n a l y s i s o f s u g a r s o r g ani c a c i d s a n d v i t a m i n C c o n t e n t s o f b l a c k b e r r y g e n o t y p e s f r o m T u r k e y J F o o d C h e mi s t r y 2 0 0 6 9 7 4 7 3 2 7 3 6 5 M u c h u w e t i M Z e n d a G N d h l al a A e t a 1 S u g a r s o r g ani c a c i d and p h e n o l i c c o m p o u n d s o f Z i z i p h u s m a u r i t i a n a f r u i t J E u r o p e a n F ood R e s e a r c h a n d T e c h n o l o g y 2 0 0 5 2 2 1 3 2 4 5 7 0 2 5 7 4 6 李金昶 王元鸿 崔秀君 等 高效液相色谱法分离和测定酒石酸和马来酸 J 分子科学学报 2 0 0 0 1 6 2 1 2 5 1 2 7 7 孟霞 彭敬东 刘绍璞 高效液相色谱法测定蜂胶液中的6种有机酸 J 西南大学学报 2 0 0 8 3 0 9 6 6 7 0 8 施介华 徐秀珠 反相高效液相色谱法分离和测定富马酸 J 分析化学 2 0 0 0 2 8 4 4 7 0 4 7 2 9 丁明玉 陈培榕 罗国安 食品中有机酸的高效液相色谱分析法 J 色谱 1 9 9 5 1 5 3 2 1 3 2 1 5 1 0 董彩霞 董园园 王健 等 同一流动相测定植物体内 l 2中有机酸和维生素 c的高效液相色谱法 J 土壤学报 2 0 0 5 4 2 2 3 3 1 3 3 5 1 1 张晋芬 袁冰 徐华龙 等 高效测定水果中有机酸的反相液相色谱法 J 复旦学报 2 0 0 8 4 7 4 4 7 3 4 7 7 1 2 李康乐 吴梧桐 宋祥珍 等高效液相色谱法同时测定药用苹果酸中的马来酸与富马酸 J 中国药科大学学报 1 9 9 4 2 5 2 1 0 6 1 0 8 责任编辑 张红琳 D e t e r mi n a t i o n o f Ma l e i c A c i d a n d S a l i c y l i c Ac i d i n Ho n e y b y I I i g l l P e r f o r ma n c e Li q u i d Ch r o ma t o g r a p h y Ta n de m M a s s S p e c t r o me t r y Z HOU Ho n g x i a Z HAN G F e n g XU We i YA NG We n q u a n UU H a n XU J i n z h o n g 1 S c h o o l o f B i o c h e m i s t ry a n d E n v i r o n me n t a l E n g i n e e r i n g N a J 1j i n g X i a o z h u ang U n i v e rs i t y N a n j i n g 2 1 1 1 7 1 J i a n g s u 2 F o o d L a b o r a t o r y J i ang s u I m p o r t E x port I n s p e c t i o n a n d Q u ar ant i n e B u r e a u N a n j i n g 2 1 0 0 0 1 J i a n g s u Abs t r a c t Th e me t h o d o f Hi g h Pe r f o r ma n c e Li q ui d Ch r o ma t o g r a p h y Ta n de m Ma s s S p e c t r o me t r y i s a d o p t e d t o d e t e r mi n e ma l e i c a c i d a n d s a l i c y l i c a c i d i n h o n e y a n d c h r o ma t o gra p h i c a n a l y s i s i s p e r f o rm e d