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第十八章支原体 衣原体 立克次体 第一节支原体是一类缺乏细胞壁 形态上呈高度多形性 能通过除菌滤器 在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物 由于它们能形成有分支的长丝 故称之为支原体 1 支原体科分支原体属和脲原体属两个属 对人致病的主要为肺炎支原体 人型支原体 生殖器支原体 穿通支原体和溶脲脲原体 除此之外 支原体还经常污染细胞培养 给实验室病毒分离 单克隆抗体制备等工作带来一定困难 2 一 肺炎支原体 感染呈全球性分布 主要侵犯呼吸系统 借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障 主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白 称Pl蛋白 3 是青少年急性呼吸道感染的主要病原体 表现为上呼吸道感染综合征 占非细菌性肺炎的1 3以上 过去认为是温和的病原体 现在认为它也可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症 如心肌炎 心包炎 免疫性溶血性贫血 肾炎等 4 微生物特性 1 形态与结构类似酒瓶状 没有细胞壁 仅有细胞膜 G 易着色 Giemsa染色呈淡紫色 细胞膜中胆固醇含量多 所有肺炎2株共同具有P1蛋白 是主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原 5 2 抗原结构来自细胞膜 胞膜外层蛋白质是主要抗原 常用生长抑制试验 GIT 与代谢抑制试验 MIT 鉴定 GIT是将吸有型特异性抗血清的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上 经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现象 MIT是将支原体接种在含有抗血清培养基中 若抗体与支原体型一致 则抑制该支原体不能分解葡萄糖产酸 此两种方法可将支原体分成若干血清型 6 3 培养特性以二分裂繁殖 繁殖较慢 生长需要胆固醇 反复传代后呈 荷包蛋 状菌落 可迅速溶解哺乳动物红细胞 4 生化反应肺炎支原体可根据是否能利用葡萄糖 水解精氨酸和尿素来与其他支原体进行鉴别 7 5 抵抗力 1 对热的抵抗力一般与细菌相似 耐冷 70 或液氮可长期冻存 4 放置也不要超过3天 2 支原体对干燥敏感 干燥的标本难以分离出支原体 没有细胞壁青霉素不敏感 8 检验程序 1 标本采集肺炎支原体有粘附细胞作用 以咽拭子标本为好 取材后宜立即接种 2 PCR法快速 敏感和特异 目前某些临床实验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中检测肺炎支原体DNA 3 电子显微镜观察无细胞壁 易与细菌鉴别 9 4 分离培养 以牛心消化液为基础 加20 小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基 加入青霉素 可防止杂菌生长 初次分离生长缓慢 在含5 C02下培养 10天长出油煎蛋状菌落 能发酵葡萄糖产酸 不能利用精氨酸与尿素 可还原美蓝 分离培养阳性率不高 对临床诊断意义不大 但对流行病学调查有重要意义 10 5 抗体检测 1 ELISA 此法敏感 特异性高 快速 经济 并可检测IgM和IgG抗体 为目前诊断的可靠方法 检测分子量190kDa的P1蛋白 3h可完成试验 特异性高 敏感性为104CFU l标本 11 2 补体结合 CF 试验 试验所用的抗原为氯仿 甲醇提取的糖脂类抗原 双份血清试验 效价呈4倍增长者 或单份血清效价 l 128者 80 的病例表明近期有肺炎支原体感染 12 3 间接血凝试验 操作简便 敏感度略高于补体结合试验 感染发病后7天出阳性 10 30天达高峰 12 26周逐渐降低 本试验与补体结合试验类似 主要测lgM抗体 与生殖道支原体之间存在交叉反应 13 4 冷凝集试验 是一种非特异性试验 其方法是将患者血清与O型Rh阴性红细胞在4 下作凝集试验 有33 76 肺炎支原体感染者为阳性 效价 1 64 效价越高或双份血清呈4倍以上升高 肺炎支原体近期感染的可能性越大 14 二 解脲脲原体 也称溶脲脲原体 是1954年Shepard首先从非淋菌性尿道炎 NGU 患者的尿道分泌物中分离获得 因其分解尿素的特性命名为解脲脲原体 在分类学上属人支原体科脲原体属 是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一 近年来研究发现 它与多种疾病有关 故引起国内外有关学者的广泛重视 15 1 寄居泌尿生殖道 传播途径为性接触和母婴传播 致病机制与侵袭性酶有关 吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂 脲酶分解尿素产氨 影响宿主细胞生物合成 产生IgA蛋白酶 破坏IgA的局部抗感染作用 有利于粘附和致病 16 2 引起非淋菌性尿道炎 NGU 上行感染 可引起前列腺炎或附睾炎 阴道炎和宫颈炎 并可导致流产 因为与人精子膜有共同抗原 对精子可造成免疫损伤而致不育 17 微生物特性 1 形态结构在液体培养基中以球形为主 直径约50 300nm 单个或呈双排列 能通过微孔滤膜 G 但不易着色 姬姆萨染色呈紫蓝色 无细胞壁 细胞膜由三层膜构成 内 外两层由蛋白质组成 中层为类脂质 胞内含核糖体和双股DNA DNA中 十C含量为26 9 29 8mol 18 2 培养特性 营养要求较高 需要供给胆固醇和酵母 常用的基础培养基为牛心消化液 37 生长良好 22 生长差 42 不生长 最适pH为5 5 6 5 在含95 N2和5 C02气体环境下培养2天形成很小菌落 呈 荷包蛋 样 放大200倍才能观察到 故称T株 生长除胆固醇外 尚需尿素 有脲酶能水解尿素产氨 不分解葡萄糖和精氨酸 19 3 抗原构造 有脂多糖 脲酶和蛋白质抗原 有16个血清型划分为A B两大群 其中以4型引起疾病频率高 A群各型均含有16kD和17kD多肽 B群各型仅含17kD多肽 而13血清型只含有16kD多肽 以能识别16kD和17kD多肽的单抗 为区别血清群特异性标志 20 4 抵抗力 由于无细胞壁 对渗透作用特别敏感 易被脂类溶媒 清洁剂 酒精 特异性抗体和补体溶解 对热抵抗力差 在4 存活约2周左右 70 中可存活2 3年 对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感 对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感 对强力霉素 红霉素 交沙霉素 白霉素 螺旋霉素 氯霉素 麦迪霉素 链霉素 丁胺卡那霉素等敏感 21 微生物检验 1 标本采集用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中段尿 慢性前列腺炎按摩后的前列腺液 原因不明的不育症患者的精液 阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物 羊水和血液等 尿标本以无菌方法取10ml 离心沉渣作接种物 22 2 标本直接检查 1 核酸检测16个血清型均有460bp的DNA片段 通过对PCR产物的核酸杂交和序列分析 可将各种支原体鉴别分类 鉴于本法敏感性高 稳定可靠 快速简便 将成为临床快速诊断的重要实验手段 DNA探针技术法敏感 可测出50 100pg的DNA 23 2 ELISA可测定血清型别 还可测出Ig的类型 IgM IgG 较敏感 特异性强 有诊断意义 3 免疫斑点试验 IDT 检测抗原提取物和培养物 此法敏感 特异性 不需特殊仪器 易于推广 可作为临床感染者病原检查的特异诊断方法 24 3 分离与鉴定 取标本O 1 0 2ml接种于pH6 0含有酚红和尿素的液体培养37 孵育 颜色由黄变红者为阳性 阳性者转种于固体培养基上 琼脂培养基中有尿素 0 05molHEPES缓冲液和MgS04 菌落呈黑褐色易辨认 95 N2 5 C02或微厌氧环境中作次代培养 以低倍镜观察菌落形态 25 经形态和生化反应等检测可作出初步鉴定 只分解尿素 不分解葡萄糖和精氨酸 用特异抗血清作MIT和GIT作进一步鉴定 26 三 穿通支原体 能粘附 穿入淋巴细胞和单核吞噬细胞中大量复制 导致宿主细胞受损和死亡 能促进HIV的复制和病程的发展 是艾滋病的辅助致病因素 27 为杆状 一端为尖形结构 营养要求高 菌落呈荷包蛋样 生长较慢 初代多在10天以上 发酵葡萄糖 水解精氨酸 但不分解尿素 液体培养基生长时无明显混浊或沉淀 对红霉素 四环素 林可霉素敏感 但对青霉素不敏感 28 微生物检验 1 标本采集取材对象是AIDS患者或HIV感染者 用咽拭子 2 选SP 4培养基分离培养 37 温箱培养 每天观察颜色有无变化 若由红变黄透明无沉淀 视 培养可疑阳性 再用滤膜过滤 滤液转种传代 当培养基颜色再度由红变黄 则认为 初代培养阳性 29 3 鉴定 生化反应 1 培养物接种于含1 葡萄糖的SP 4培养基 发酵葡萄糖试验 若能分解它 培养基颜色由红变黄 2 培养物接种于含有精氨殿 不含葡萄糖 的SP 4培养基 水解精氨酸试验 中 若能水解它 pH上升 3 培养物接种于仅含尿素的SP 4培养基 分解尿素试验 中 观察pH变化 30 代谢抑制试验 MIT 取104CFU ml阳性培养物分别加入2支含3ml改良的SP 4培养基中 其中1支加入适量抗Mpe标准血清作为试验管 另1支不加抗血清作为对照管 37 培养 试验管颜色不变 生长被抑制 对照管颜色由红变黄 支原体生长 生长被杭血清抑制的管为MIT阳性 该培养物则为Mpe 根据抗血清的型别进行Mpe分型 31 PCR 用Mpe套式PCR nPCR 靶基因为Mpe的16SrRNA基因特异性片段 Mpe nPCR最终扩增长度为410bp 按试剂盒说明书操作 能扩增出特异性MpeDNA 认为此法更灵敏 特异 快速的Mpe检测方法 32 抗体检测 国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测出大量Mpe抗体 其中无症状者的阳性率为20 有艾滋病者为40 阴性对照0 3 33 第二节衣原体 是一类专性细胞内寄生 有独特发育周期 能通过细菌滤器的原核细胞型微生物 归属于广义的细菌范畴 衣原体科包括沙眼衣原体 肺炎衣原体 鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种 34 一 沙眼衣原体 不仅可致眼部感染 而且可引起生殖泌尿系统感染 性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病 近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首 因而日益受到医学界的重视 沙眼衣原体有沙眼生物变种 性病淋巴肉芽肿生物变种 LGV 和鼠生物变种等3个生物变种 35 1 沙眼亚种 1 沙眼 通过眼 手 眼途径直接或间接密切接触传播 由A B Ba和C血清型引起 结膜引起局部炎症 有滤泡增生 后期出现瘢痕及角膜血管翳 影响视力 36 2 包涵体结膜炎 由B Ba D Da等血清型引起 婴儿通过产道感染 引起滤泡性结膜炎 不出现角膜血管翳 3 泌尿生殖道感染 由D K血清型引起 在性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染 50 60 易发展为持续感染或无症状携带者 37 2 性病淋巴肉芽肿亚种 由L血清型引起性病淋巴肉芽肿 侵犯腹股沟淋巴结 引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿 3 鼠生物变种为鼠间传播 不侵犯人 与鼠肺炎有关 38 微生物特性 1 发育周期与形态染色衣原体具有特殊的发育周期 原体是细胞外存在形式 卵圆形 有胞壁和拟核 是发育成熟的衣原体 具有高度感染性 能吸附于易感细胞特异受体 增大形成网状体 网状体或称始体 圆形 二分裂增殖为繁殖型 无感染性 于感染24h后浓缩形成原体 最后细胞破裂释放原体 再感染其他细胞 每个发育周期约需48 72h 39 抗原结构 复杂 有属 种 型等特异性抗原 1 属特异性抗原 为胞壁LPS 属特异性补体结合抗原 应用于血清学诊断 2 种特异性抗原 位于主要外膜蛋白 MOMP 上 可用补体结合试验和中和试验检测 3 型特异性抗原 也位于MOMP上 用单克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼体的18个型别 40 培养特性 沙眼衣原体专性活细胞内寄生 用6 8d龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养 一般培养48 72h后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒 近年多采用细胞培养衣原体 常用的细胞株为Hela 299和McCoy 41 抵抗力 沙眼衣原体感染材料在37 条件下 经48h左右即失去活力 56 6min灭活 70 可保存数年 冷冻干燥可保存30年以上仍有活性 O 1 甲醛或O 5 石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体 2 来苏仅需5min 红霉素 四环素 强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用 42 沙眼和包涵体结膜炎病人 用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片 性病淋巴肉芽肿 采淋巴结脓汁 也可取直肠拭子或活检材料送检 用光学显微镜观察包涵体有诊断意义 特别在眼结膜 尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考 43 免疫学方法 1 免疫荧光检查 用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原 标记抗衣原体LPS抗体 可与所有衣原体反应 而抗MOMP抗体有种 型特异性 可在1h内即作出诊断并可分型 2 酶免疫检测 能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原 并适用于同时检测大量标本 44 核酸检测 1 核酸杂交 用125I标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性 与培养相比分别为82 8 和99 4 2 PCR 具有高度敏感性和特异性 一般按沙眼衣原体7 5kb质粒 MOMP序列及16SrRNA基因序列设计引物 45 分离培养 将标本拭子 用含抗生素的稀释液制成10 20 悬液 分离的细胞有McCoy HeLa 229细胞等 置5 CO2下培养 初代分离培养72 96h后传代或盲传 有症状病人90 标本第1代即可见包涵体 而无症状病人需传代后才得到阳性 敏感性为80 90 特异性100 是目前确诊最可靠的方法 而且是评价实验室诊断法的标准 46 鸡胚培养 有细菌污染的临床标本加适当的抗生素 如链霉素 庆大霉素和制霉菌素等 肉汤 在室温中作用lh后 接种3 4只孵育7天的鸡胚卵黄囊 35 孵育 观察至13天 收获卵黄囊涂片 作Gimenez染色 镜检原体 47 鉴定 1 将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体 Giemsa染色比碘染色敏感 可作为鉴别沙眼衣原体的参考 2 可用型特异性荧光血清鉴定其型别 对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原 48 抗体检测 目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小 原因是不易获得双份血清 而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染 原有的抗体水平较高 因而限制了血清学方法的诊断价值 方法有补体结合试验 CF 微量免疫荧光试验 MIF 酶免疫法等 其中CF敏感性和特异性较差 而MIF敏感性和特异性较高 49 三 鹦鹉热衣原体 鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体 主要引起禽畜感染 也可由动物传染到人 引起肺炎和毒血症 亦有引起心内膜炎的报道 也有衣原体独特的生活周期 包涵体较致密 形态不一 碘染色阴性 是与沙眼衣原体鉴别要点 沙眼衣原体含糖原 碘染色阳性 50 抗原检测 1 免疫荧光检查 以衣原体属 种或型的单克隆抗体与荧光素结合后中衣原体抗原的存在 用微量免疫荧光法还可用于衣原体的分型 2 酶免疫法 EIA 检测 将衣原体单克隆抗体与酶结合 用于组织或细胞的染色 枪测衣原体抗原 E1A法比免疫荧光法准确性略高 且可避免主观因素的影响 51 核酸检测 1 核酸探针检测法 将衣原体MOMP基因 特异LPS表位基因 及其他决定鹦鹉热衣原体抗原的基因片段做成探针 对衣原体DNA进行斑点杂交或Southern印迹杂交试验 可准确灵敏测出鹦鹉热衣原体 也可用于种内株系的鉴别 2 PCR 检测3种衣原体的MOMP基因序列是简便 微量 快速 敏感的检测力法 52 分离培养 1 鸡胚培养 鹦鹉热衣原体的分离常用鸡胚卵黄囊接种与传代 可取得满意效果 2 小鼠分离 选择腹腔接种 颅内接种和滴鼻接种进行试验 最具特征性的发现小鼠嗜眠和麻痹 胀气的十二指肠上覆盖一层薄的粘性渗出物 全肺叶有实变 53 3 细胞培养 细胞培养常用PL细胞 BHK细胞 Vero细胞等 鹦鹉热衣原体均能生长 但直接用于临床标本的分离培养效果不好 最好先接种鸡胚卵黄囊 经繁殖后再细胞培养容易成功 54 抗体检测 方法有补体结合试验 CF 间接血凝试验 IHA 和酶联免疫吸附试 ELISA 等 补体结合试验 主要用于鹦鹉热和性病淋巴肉芽肿以及肺炎的试验 CF抗体效价呈4倍增长者可作诊断 一次CF抗体结果 需效价高于1 64才可能作临床诊断 55 四 肺炎衣原体 肺炎衣原体是衣原体属中的一个新种 只有一个血清型 是一种重要的呼吸道病原体 主要引起青少年急性呼吸道感染 可引起肺炎 支气管炎 咽炎和鼻窦炎等 还可引起心包炎 心肌炎和心内膜炎 肺炎衣原体性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系 越来越引起人们的注意 56 微生物特性 1 有衣原体独特的生活周期 原体在电镜下呈型的梨形 并有清晰的周浆间隙 2 全基因组测序已完成 与鹦鹉热衣原体 沙眼衣原体的DNA同源性 10 而不同来擗TWAR株都具有94 以上的DNA同源性 其限制性内切酶的图谱相同 其单克隆抗体与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应 3 用HEp 2和HL细胞系较易分离和传代 57 抗体检测 以微量免疫荧光试验 MIF 最为敏感 该试验阳性者50 70 可分离出TWAR 用此法检测特异性的IgM和IgG抗体 有利于区别近期感染和既往感染 也有利于区别原发感染和再感染 TWAR的再感染相当常见 特别是老年人 再感染时一般不出现lgM和补体结合抗体 58 第三节立克次体 对人致病的立克次体有五个属立克次体属 柯克斯体属 东方体属 埃立克体属和巴通体属 59 共同特点 大多是人畜共患病原体 引起人类发热和出疹性疾病 以节肢动物为传播媒介或为储存宿主 大小介于细菌与病毒之间 光镜下呈多形态性 主要为微 杆状或球杆状 革兰阴性 除了少数外全是专性活细胞内寄生 菌体内同时含有DNA和RNA两类核酸 以二分裂方式进行繁殖 对抗生素敏感 60 一 斑疹伤寒立克次体 一 临床意义1 普氏立克次体是流行性斑疹伤寒 又称虱传斑疹伤寒 的病原体 病人是惟一的传染源 体虱是主要传播媒介 而非储存宿主 传播方式为虱 人 虱 体虱仅是传染媒介 61 莫氏立克次体 地方性斑疹伤寒 又称鼠型斑疹伤寒 的病原体 啮齿类动物是主 宿主 传播媒介是鼠蚤或鼠虱 鼠蚤叮咬人体时 常排粪于皮肤上 斑疹伤寒立克次体从抓破的伤口进入人体 若有人虱寄生 可通过人虱为传播媒介 继发性地在人群中传播 62 致病物质 有两种 其一是内毒素 主要成分为脂多糖 LPS 其二为磷脂酶A 能损伤宿主细胞膜及溶解胞内吞噬体膜 以利于病原体穿入宿主细胞并在其中生长 普氏和莫氏立克次体所致的斑疹伤寒症状相似 以高热 头痛 全身皮疹为主要特征 伴有神经系统 心血管系统等症状和实质性器官损伤 63 二 微生物特性 1 比细菌小 呈多形态性 在感染细胞内聚集成团 分布在胞质内 Gimenez法染色后呈红色 外表含有微荚膜结构 2 必须在真核细胞内才能生长繁殖 培养时需要C02 通常采用5 9日龄鸡胚作卵黄囊接种 于32 35 孵育4 13d内死亡 鸡胚死亡时间与接种剂量大小呈直接相关 普氏和莫氏立克次体能在多种单层细胞上生长繁殖 豚鼠可作立克次体的初代分离 64 3 有群特异性和种特异性两种抗原 大部分立克次体与普通变形杆菌X菌株的菌体耐热多糖抗原有共同的抗原性 故可用这些菌株代替立克次体抗原进行凝集反应去检测抗体 这种交叉凝集试验被称为外斐反应 可供辅助诊断 65 外斐反应 66 三 微生物检验 1 标本采集 1 病人血液标本 发热期均有立克次体血症 在急性期较易检出立克次体 争取在用抗生素前采血 立即床侧接种 2 活检或尸检材料 肺 肝 脾 淋巴结 心瓣膜等标本 67 2 标本直接检查 1 免疫荧光检测用于脏器检查 制备标本片薄而均匀 组织结构清晰 固定后用荧光抗体染色 常见脾 肺及心瓣膜中有立克次体 也可在肝 肾及皮疹活检组织中检出 2 核酸检测PCR敏感性高 所需样品量只需ELISA实验的1 5 以编码17kD蛋白的基因和编码普氏和莫氏立克次体169kD蛋白的基因作为扩增靶区 68 引物R17 1 2在65 条件下能扩增普氏和莫氏立克次体DNA 在琼脂凝胶上产生一条340bp的核酸带 引物R169 1 2仅能扩增普氏立克次体DNA 产生一条432bp的核酸带 两种引物同时使用 扩增后普氏可产生340bp和432bp两条带 而莫氏只产生340bp一条带 该法敏感性可达0 05ngDNA水平 重复性好 操作方便 对两型立克次体早期 鉴别诊断以及自然生态宿主调查研究具有较大价值 69 3 分离培养 1 动物接种选用健康雄性豚鼠接种以便观察阴囊肿胀现象 每日测体温 至40 发热时采血或脏器悬液 接种鸡胚卵黄囊或细胞培养以分离立克次体 感染莫氏立克次体豚鼠在发热1 2日内出现阴囊红肿 解剖可见腹股沟淋巴结肿大 充血 脾大2 3倍 有腹水 有阴囊反应者 睾丸有小出血点 鞘膜充血并有浆液性渗出物等 鞘膜涂片可查到立克次体 70 2 鉴定 用免疫荧光法鉴定感染动物脏器 鸡胚卵黄囊 细胞培养物中的特异性抗原以已知抗原测定动物恢复期血清中的相应抗体 必要时用补体结合试验 微量凝集试验等 作群和种的鉴定 71 3 分离株繁殖及保存 鸡胚卵黄囊培养收获卵黄囊 经涂片染色镜检 含立克次体较多而又未发现细菌的卵黄囊膜 或将其作成适当浓度的悬液置 70 冰箱保存 或冰冻干燥保藏 细胞培养 选鸡胚 成纤维 人羊膜 HeLa等细胞 接种培养 鉴定后将立克次体大量繁殖的感染细胞置 70 储存 72 4 抗体检测 立克次体病常用的血清学诊断方法除外斐反应 间接免疫荧光 IFA 试验 酶联免疫吸附试验 ELISA 外 还有补体结合 CF 试验 微量凝集 MA 试验 间接血凝 IHA 试验 胶乳凝集 LA 试验等 73 1 外斐反应 除Q热 立克次体痘及罗沙利马体感染为阴性外 其他为阳性 患者OX凝集素上升较晚 在病程2周左右方出现阳性 病程中双份血清试验 若效价有4倍增长 方有诊断意义 74 有些病例在病程中效价不见上升 约15 的经疫苗接种后感染斑疹伤寒的病例 有些轻症斑疹伤寒或某些发病严重者 其他血清学试验阳性 但外斐反应可为阴性 斑点热病人外斐反应效价通常为OX19高于OX2 但也有OX2较高者 若仅出现OX2阳性 则对诊断斑点热有特殊意义 75 2 IFA试验 为现在诊断立克次体病常用的方法 用已知立克次体抗原 感染鸡胚卵黄囊或细胞培养悬液 制片 以低稀释度的病人血清初筛 有呈典型立克次体形态的明亮荧光颗粒者 判为阳性 再将病程早期及晚期血清分别作双倍或4倍稀释以测效价 如呈4 8倍增长者可明确诊断 76 3 ELISA 检测IgM抗体对早期诊断有价值 立克次体抗原吸附于载体 泛影葡胺梯度离心纯化抗原为优 检出血清的抗体效价高 纸上ELISA测定抗体 方法简便 将感染卵黄囊悬液加于玻片 经氯仿 甲醇洗净 上 凉干 固定 加稀释血清于抗原点上 每张玻片上包括阳性和阴性对照 加酶标兔抗人IgM G于抗原 血清点作用后 将浸透新鲜配制的底物无灰滤纸覆盖在玻片上约4 6min 可见滤纸条上阳性对照点位置显紫棕色 取下滤纸条 即终止反应 观察是否显色 与对照比较判定结果 此法简便 并可保存实验记录 77 4 CF试验 CF试验原来是立克次体病血清学诊断的经典试验 虽然敏感性不如IFA和ELISA 但非常特异 一般在立克次体病发病一周内 血清中即有CF抗体出现 以后逐渐上升 至第3周达最高峰 然后逐渐降至较低的效价 并可保持几年不消失 但也有在病后几周即转阴性者 病人恢复期血清与斑疹伤寒群及斑点热群立克次体可溶性抗原试验的阳性结果 只能说明该群立克次体的感染 78 三 恙虫病立克次体 又名东方立克次体是恙虫病的病原体 由恙螨叮咬侵入人体 对人体致病性很强 释放的毒素样物质是主要致病因素 引起发热皮疹全身中毒症状 以及全身淋巴结肿大及各组织器官的血管炎病变 虫咬处溃疡形成黑色焦痂 周围有红晕等为其特征 为自然疫源性疾病 79 一 微生物特性 1 具有多形性 但以短杆状为常见 G 姬姆萨染色呈紫红色 Gimenez染色呈暗红色 背景为绿色 可以鉴别恙虫病立克次体和其他立克次体 分布在细胞质内 密集于细胞核旁 细胞内寄生 80 2 培养特性 1 动物接种 小鼠最敏感 刮取腹膜上的粘液涂片检查 可见细胞质内有大量立克次体 尤以腹膜上皮细胞内多见 常密集于细胞核旁 81 2 细胞培养 恙虫病立克次体可以在多种细胞内生长 繁殖 多采用Vero L929细胞进行培养 细胞感染需要适宜的温度和吸附时间 通常以37 吸附1h 培养32 为宜 繁殖缓慢 用Vero细胞培养8 9d 在细胞质内生长繁殖 在细胞核旁高度密集 但不侵入细胞核 82 3 抗原成分 恙虫病立克次体具有耐热性多糖抗原和特异性抗原 恙虫病立克次体和变形杆菌OXk株有共同的抗原成分 在Weil Felex反应中 血清与OX 抗原发生凝集而不与OX19 OX2发生凝集 83 二 微生物检验 1 抗原检测 ELISA间接法是检测标本的特异性抗原或抗体的最常用方法 2 PCR 可检出20ng恙虫病立克次体DNA 套式PCR法可检出200pg 是目前最为快速 特异 敏感的实验室诊断方法 可用于急性期患者的早期诊断 依据56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因序列选择引物 进行目的DNA扩增 然后用1 5 琼脂糖电泳法检出特异性DNA带 84 3 分离培养 接种小鼠分离病原 将标本接种腹腔O 5ml 一般多在7 18天死亡 感染小鼠有明显症状 濒死前解剖 可见皮下淋巴结肿大充血 脾肿大 有粘稠的腹腔渗出液 以Giemsa染色镜检 在靠近细胞核旁边可见成堆排列的立克次体 也可接种Vero细胞 L929细胞进行立克次体分离培养 细胞培养10 15天 取细胞涂片 Giemsa染色镜检 85 4 抗体检测 外斐试验 临床血清学诊断方法 血清抗体OXk效价达l 160以上有意义 病程中双份或多份血清试验 若效价有4倍增高 有诊断意义 由于外斐试验特异性 敏感性低 容易造成误诊或漏诊 不应作为恙虫病的诊断方法 86 免疫荧光试验 快速敏感特异 可分别检测患者血清中的抗恙虫病立克次体lgG IgM抗体 效价在1 80以上有诊断意义 双份血清有4倍或以上增长可以确诊 87 四 贝纳柯克斯体 又称Q热立克次体 是引起Q热 疑问热 指最初不明病因的发热 的病原体 传染源主要是受染的牛 羊等家畜 以蜱为传播媒介 对人感染力特别强 通过接触 呼吸道 消化道等途径使人及动物发生感染 Q热除有发热 头痛及肌肉痛外 以出现肺炎和肝炎为其临床特征 慢性Q热主要表现为心内膜炎 88 一 微生物特性 1 形态与结构个体较小 多为短杆状 常排列成对 Gimenez法染色呈红色 背景呈绿色 用Giemsa法染色呈紫红色 有荚膜 在鸡胚卵黄囊或细胞培养内均可有芽胞形成 2 基因组与抗原成分基因组分子量为大肠杆菌的1 3 编码代谢酶 表面抗原与毒力因子有关基因 有两相抗原 相为光滑型LPS 相为粗糙型短链LPS 89 3 培养特点 鸡胚是培养的极好宿主 一般经培养10 12d 1g卵黄囊膜常可获得约1000 g纯净的立克次体能在多种人和动物的原代或传代细胞内繁殖 一般不引起明显的细胞病变 90 4 抵抗力 贝纳柯克斯体抵抗力强 70 90 加热30 60min尚难杀死 1 福尔马林作用24小时也不能完全灭活 对氯霉素和四环素类抗生素敏感 91 二 微生物检验 1 标本直接抗原检测 免疫荧光法进行检测 2 标本直接核酸检查 按16SrRNA非保守区序列合成寡核苷酸探针 能检出5pgrRNA 如将非保守区特异性扩增 其敏感性可达检出1 10个贝纳柯克斯体的水平 用贝纳柯克斯休质粒DNA片段制备的探针 不仅能快速检出病原体 且能鉴别含QpHI或QpRS质粒分离株 与呼吸道感染病原体DNA无交叉反应 试验仅需8 12h即可得到结果 92 3 分离培养 病原体分离只是在该地区尚未证明有Q热存在 病情特别严重有必要 将标本接种于豚鼠或培养细胞 观察其发病与否或生长情况 经形态学 血清免疫学等鉴定后作出结论 93 4 抗体检测 用间接免疫荧光试验 ELISA和CF试验 CF试验中抗原相的选择对结果影响极大 对现症诊断主要看 相抗体逐渐上升 若 相抗体保持较高水平 则往往说明慢性感染或隐性感染 94 五 埃立克体 一 临床意义为埃立克体病病原体 1 人腺热埃立克体病可能由蜱传播 也可能由于摄食生鱼引起 临床表现为发热头痛 淋巴细胞数增加 并出现非典型淋巴细胞 2 人单核细胞埃立克体 HME 病 主要侵染人的单核细胞和巨噬细胞 传播媒介为蜱 95 3 人粒细胞埃立克体 HGE 病主要侵犯人粒细胞 硬蜱是传播媒介 也是莱姆病病原体的携带和传播者 故与莱姆病的相重叠 96 二 微生物特性 1 为G 小球菌 呈多形性 Romanows染色呈兰色和紫色 吞噬细胞以内吞的方式将埃立克体摄入胞内 在胞质内以二分裂的方式繁殖 形成包涵体 称为桑椹体 97 2 基因组埃立克体的16SrRNA基因极保守 但5 端的50 100碱基为高变区 适合设计PCR引物或核酸杂交探针 人粒细胞埃立克体的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆 可用作探针 3 抗原成分在埃立克体属内的各种埃立克体均可有血清学交叉反应 98 三 微生物检验 1 标本直接显微镜检查采集病人的外周血制备血片 经Giemsa或Wright染色 在光镜下发现粒细胞及单核细胞质或血小板内有圆形 深紫色的桑椹体 可作为急性期埃立克体病的一种简便和有效的辅助诊断方法 99 2 核酸检测 PCR是最有效的埃立克体病的病原学诊断方法 可用于埃立克体病的早期诊断 大约80 87 HME和43 75 的HGE患者的血标本被PCR检测为阳性 特异性几乎为100 主要依赖引物的特异性 可用16SrRNA基因设计引物或做基因探针 有极高的敏感性 感染后数天就可检出阳性结果 100 3 细胞培养 查菲埃立克体可用犬巨噬细胞系 DH82 腺热埃立克体用小鼠的巨噬细胞