晚期氧化蛋白产物对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响.doc

晚期氧化蛋白产物对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响 作者：李忠海；刘尚喜；侯凡凡；王燕群(南方医科大学南方医院肾内科，广东广州510515)摘要：目的研究晚期氧化蛋白产物(AOPP)对小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)产生一氧化氮的影响。方法用次氯酸氧化牛血清白蛋白(BSA)制备的AOPP-BSA 单独或与内毒素(LPS)一起与MPM共同培养或用AOPP-BSA预处理后再用LPS刺激MPM,用Griess试剂法测定培养上清一氧化氮的含量；MTT法测定细胞活力。结果AOPP修饰可使BSA诱导MPM产生一氧化氮的量显著性降低。同时，AOPP-BSA预处理或与LPS一起共同刺激巨噬细胞均可显著性抑制LPS诱导的MPM产生一氧化氮,抑制程度与BSA的氧化修饰程度AOPP-BSA的浓度有关。结论晚期氧化蛋白产物可抑制MPM诱导型一氧化氮的产生。关键词：晚期氧化蛋白产物；氧化应激；巨噬细胞；一氧化氮中图分类号：Q251文献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)05-0558-03Effect of advanced oxidation protein products on nitric oxide production in mouse peritoneal macrophagesLI Zhong-hai； LIU SHANG-Xi； HOU Fan-fan； WANG Yan-qunDePartment of Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, ChinaAbstract: ObjectiveTo investigate the effect of advanced oxidation protein products (AOPP) on nitric oxide (NO) production in mouse peritoneal macrophages (MPMs). MethodsMPMs were incubated in the absence or presence of lipopolysaccharide (LPS) with AOPP-modified bovine serum albumin (BSA) prePared by exposure of BSA to hypoclorous acid or pre-treated with AOPP-BSA and subsequent stimulation with LPS. NO production in the supernatants of the culture media was determined spectrophotometrically using Griess method. The cell viability was measured by MTT assay. ResultsBSA induced significant NO production in MPMs. AOPP modification of BSA significantly inhibited NO production, and AOPP-BSA exhibited time- and dose-dependent inhibition of NO production induced by LPS in MPMs incubated together with LPS or pre-treated before LPS stimulation. ConclusionAOPP-BSA is caPable of inhibiting inducible NO production in MPMs.Key words: advanced oxidation protein products; oxidative stress; macrophages; nitric oxide收稿日期：2005-10-24基金项目：国家自然科学基金重点项目(30330300)、面上项目(30370370)Supported by National Natural Science Foundation of China(30330300, 30370370)作者简介：李忠海(1981-)，男，在读硕士研究生，电话E-mail:通讯作者：刘尚喜，电话：61641591，E-mail: 终末期肾脏病(ESRD)患者体内存在氧化与抗氧化机制的失衡，即氧化应激。持续的氧化应激可造成DNA、脂质和蛋白质的损伤1。晚期氧化蛋白产物(AOPP)是在慢性肾衰病人体内发现的一种与氧化应激有关的蛋白质氧化产物，其特征是含有大量的双酪氨酸，酸性条件下在340 nm 处有特异吸收峰。AOPP在体内可能是由激活的中性粒细胞产生的次氯酸氧化白蛋白的产物。体外用次氯酸与白蛋白作用可得到与慢性肾衰病人血浆中类似的AOPP2。体外研究发现，AOPP可诱导中性粒细胞和单核细胞呼吸爆发，单核细胞产生细胞因子及内皮细胞的损伤等1，345。一氧化氮(NO)在生理状态下具有重要的生物学作用包括舒张血管、抑制血小板聚集及调节细胞因子产生等。巨噬细胞产生的NO还具有重要的免疫作用。AOPP在体内是否会影响NO的产生目前还不清楚。本文研究了AOPP对小鼠腹腔巨噬细胞(MPM)产生NO的影响，旨在探讨AOPP在慢性肾衰病人免疫炎症紊乱及心血管等并发症发生发展中的可能机制。1材料与方法1.1材料无内毒素牛血清白蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS)、对氨基苯磺酸和N-萘基二乙胺，均购自Sigma 公司；RPMI 1640液体培养基，购自Hyclone公司；无酚红DMEM培养基，购自Gibco 公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司。其余试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1 无内毒素AOPP-BSA 的制备AOPP-BSA 的制备采用WitkoSarsat 等3介绍的方法。将无内毒素BSA 与次氯酸分别以1/70 和1/140 的摩尔比混合，室温反应30 min，制备出两种不同氧化修饰程度的AOPP-BSA。制备的AOPP-BSA在PBS中4 透析24 h，除去游离的次氯酸，过滤除菌后4 保存。AOPP的含量通过测定酸性条件下340 nm的光吸收，以氯氨T为标准取得。通过上述方法制备的两种AOPP-BSA 的AOPP 含量分别为2.92 nmol/mg 蛋白和5.87 nmol/mg 蛋白，未经修饰的BSA 中AOPP 的含量为0.16 nmol/ mg蛋白。制备的所有AOPP-BSA内毒素含量低于0.25 EU/ml。1.2.2小鼠腹腔巨噬细胞的制备和培养 将小鼠拉颈处死，用70% 酒精浸泡消毒，往腹腔注射5 ml PBS，收集腹腔液，500 g离心10 min，收集细胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2106/ml，接种于96孔板，37 、 5% CO2培养箱培养，4 h后洗去未贴壁细胞，根据需要加入含不同成分的培养基继续培养。1.2.3AOPP修饰对巨噬细胞产生NO的影响 用不同浓度和不同氧化修饰程度的AOPP-BSA与巨噬细胞在无酚红、无血清的DMEM培养基中，37 、5% CO2培养箱培养不同时间,测定培养上清NO的浓度，以LPS(1 g/ml)为阳性对照，不加刺激的培养基为阴性对照。1.2.4AOPP-BSA对LPS诱导的巨噬细胞NO产生的影响 用不同浓度和不同氧化修饰程度的AOPP-BSA与LPS(1 g/ml)一起与巨噬细胞共同培养，测定培养上清NO的浓度。1.2.5AOPP-BSA预处理的巨噬细胞对LPS诱导产生NO的反应性 用不同浓度和不同氧化修饰程度的AOPP-BSA预处理巨噬细胞不同时间后，弃去培养上清，再用含LPS(500 g/ml)的DMEM培养基与细胞共同培养24 h，测定培养上清NO的浓度。1.2.6NO的测定 用Griess 试剂法测定培养上清亚硝酸盐的含量，间接反映NO的产生量。取培养上清液100 l，加入等量Griess 试剂 (1% 对氨基苯磺酸，0. 1% N -萘基乙二胺，2.5% 磷酸)，室温反应10 min，于Clin2b io128 全自动酶标仪570 nm 处测定吸光度D() 值，以NaNO2 为标准品绘制标准曲线。1.2.7细胞活性的测定用 MTT还原法测定细胞活性6。将小鼠腹腔巨噬细胞与各刺激剂共同培养32 h后，加入MTT液20 l /孔，继续培4 h。弃上清，加入二甲基亚砜150 l/孔，室温震荡10 min，于酶标仪570 nm处进行比色，结果以吸光度表示细胞活力。1.3统计学处理所有实验均重复34次，实验数据以s表示，采用SPSS 10.0 统计软件进行随机方差分析(one-way ANOVA)。2结果2.1AOPP修饰对BSA诱导巨噬细胞产生NO的影响将不同浓度BSA与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养24 h后，测定培养上清亚硝酸盐的含量。结果显示上清中亚硝酸盐的含量随BSA浓度的升高而增加，说明BSA可诱导巨噬细胞NO的产生，这与文献报道的结果一致7；而BSA经不同浓度次氯酸氧化修饰形成的AOPP-BSA与巨噬细胞共同培养，诱导产生NO的量与BSA相比显著性降低。低浓度次氯酸氧化修饰产生的AOPP-BSA(1/70)仅在较高浓度时诱导少量NO的产生，高浓度次氯酸氧化修饰产生的AOPP-BSA(1/140)则完全丧失了诱导巨噬细胞产生NO的能力。时间效应显示，BSA诱导产生NO的量随时间的延长而增加，而两种不同修饰程度的AOPP-BSA在不同的时间点诱导产生的NO量均显著性低于BSA(图1)。 图1AOPP-BSA作用不同时间对巨噬细胞产生NO的影响效应Fig.1Effect of time-course of AOPP-BSA on NO production in the macrophagesAOPP-BSA: 800 g/ml, *P0.01 vs BSA2.2 AOPP对LPS诱导的巨噬细胞NO产生的影响为了研究AOPP是否抑制巨噬细胞诱导型NO的产生，我们进一步观察了AOPP-BSA对LPS诱导的巨噬细胞产生NO的影响。将不同浓度两种不同修饰程度的AOPP-BSA (1/70；1/140)与LPS(1 g/ml)一起与巨噬细胞共同培养，测定上清NO的产量。结果显示，AOPP-BSA能显著性抑制LPS诱导的巨噬细胞NO的产生，抑制程度随AOPP-BSA浓度的增加而增强，AOPP- BSA(1/140)在浓度200，400及800 g/ml的抑制率分别为17.9%，33.5%和43.2%。相同浓度的未修饰BSA对LPS诱导的巨噬细胞产生NO没有显著性的影响。用浓度为800g/ml的AOPP-BSA与LPS(1g/ml)共同处理细胞12、24和36 h。结果发现， AOPP-BSA(1/140)在12 h即可抑制LPS诱导的NO的产生，并呈现出时间依赖作用，其抑制率分别为24.2%、40.4%和56.2%；AOPP-BSA(1/70)也表现出一定程度的抑制作用；而BSA无明显的抑制作用(图2)。 图2AOPP-BSA对LPS诱导的巨噬细胞产生NO影响的时间效应Fig.2Time-effect of AOPP-BSA on NO production induced by LPS in the macrophagesAOPP-BSA: 800 g/ml; LPS: 1 g/ml; *P0.01 vs BSA2.3AOPP-BSA预处理的巨噬细胞对LPS诱导产生NO的反应性为了阐明AOPP-BSA对LPS诱导NO产生的抑制作用是否与直接抑制NOS活性有关，我们进一步观察了AOPP-BSA预处理小鼠腹腔巨噬细胞对LPS诱导NO产生的影响。结果显示，与BSA预处理相比，两种不同修饰程度的AOPP-BSA预处理能显著性抑制LPS诱导的NO的产生，修饰程度高的AOPP-BSA(1/140)比修饰程度低的AOPP-BSA抑制效果更加明显，并呈现浓度和时间依赖效应。2.4AOPP-BSA对巨噬细胞活力的影响为了探讨AOPPBSA是否通过降低巨噬细胞活性产生对诱导型NO的抑制作用，我们进一步观察了AOPP-BSA对细胞活力的影响。将实验所用最高浓度AOPP-BSA(1 mg/ml)与巨噬细胞共同培养36 h，用MTT法测定细胞活力。结果显示，与培养基对照和BSA对照相比，两种AOPP-BSA处理对细胞活力没有显著性的影响。3讨论AOPP是体内由氧化应激引起的蛋白氧化产物，体外研究已证实AOPP具有多种生物学效应包括激活单核细胞和中性粒细胞呼吸爆发、诱导细胞因子的产生等1，345。本文的研究发现AOPP能抑制巨噬细胞诱导型NO的产生。BSA可以浓度依赖的方式诱导巨噬细胞NO的产生，与文献报道的结果一致7，而BSA经次氯酸氧化修饰形成AOPPBSA后则失去了诱导巨噬细胞NO产生的能力。其机制目前还不清楚，一种可能是BSA被氧化修饰后，其结构发生了改变，使其原有的功能丧失；另外一种可能是次氯酸修饰产生的AOPP抑制了诱导型NO的产生。进一步将AOPPBSA与LPS共同作用于巨噬细胞，发现AOPP-BSA能显著性抑制LPS诱导巨噬细胞NO的产生，说明AOPP本身具有抑制诱导型NO产生的能力。AOPP-BSA预处理也能显著性抑制LPS诱导巨噬细胞的NO的产生，说明AOPP-BSA不是直接作用于诱导型NO合酶或其催化生成的产物，而可能是通过对巨噬细胞的作用，影响了巨噬细胞对LPS刺激后诱导的NO合酶表达的能力，有关的机制还有待于进一步探讨。Moeslinger等8的研究发现，尿素可以通过抑制诱导型NO的生成，促进炎症细胞在AS粥样斑块处的增生和聚集，加速慢性肾衰病人动脉粥样硬化并发症的发生，AOPP是否会通过类似的机制参与AS的形成还有待进一步探讨。参考文献：1Witko-Sarsat V, Nguyen-Khoa T, Jungers P, et al. Advanced oxidation protein products as a novel molecular basis of oxidative stress in uraemiaJ. Nephrol Dial Transplant, 1999, 14 (Suppl 1): 76-8.2Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillere-Blandin C, et al. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremiaJ. Kidney Int, 1996, 49(5): 1304-13.3Witko-Sarsat V, Friedlander M, Nguyen AT, et al. Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failureJ. J Immunol, 1998, 161(5): 2524-32.4Witko-Sarsat V, Gausson V, Descamps-Latscha B. Are advanced oxidation protein products potential uremic toxinsJ? Kidney Int, 2003, 5(8