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2012年环境分子生物学实验第一部分：16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群实验原理：微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的监测可以不依赖于微生物的培养。过去几十年中，利用所谓的生物标记物来监测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecular microbial ecology）得到了快速发展。许多分子可以作为生物标记物，包括细胞壁成分、蛋白质、脂类、DNA或RNA。尤其是核糖体RNA（rRNA）小亚基（细菌和古细菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和相应基因的应用在微生物生态学的发展中发挥了重要的作用。以这些分子作为靶点，可以利用很多互为补充的分子技术来监测不同环境下总的细菌、古细菌和真核生物群落，以及特定的感兴趣的微生物种类。目前多以核糖体RNA小亚基基因检测作为普遍的系统发育标记物的分子指纹图谱方法，常被用于在分子微生物生态学中快速检测不同时间或空间中微生物群落组分的变化。结合数理统计分析，这些技术是研究不断变化的环境因子如何影响微生物群落构成的有力工具。目前已经建立了几种应用于环境样本中的微生物群落的指纹特征分析方法。其中最常用的方法是PCR扩增片段的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）。DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性熔点不同实现的。在5端引入GC夹（GC-clamp）可以保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有3050bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较。利用DGGE可使组成的多样性一目了然，不同序列的片段将停留在不同的位置，其中每一条带原则上代表一种细菌系群。染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分不长于500bp的PCR扩增产物上的一个碱基对的差别。该技术在快速比较不同环境中的微生物群落和监测某一特定的群落在不同时间的组成变化中非常有效。实验步骤：地表水细菌基因组DNA提取裂解液：0.05 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaCl，0.1 M EDTA（pH 8.0），1% SDS。Tris饱和酚：用1M Tris-HCl（pH 8.0）饱和的新鲜苯酚，含0.1%的8-羟基喹啉，pH7.8。酚/氯仿/异戊醇：Tris饱和酚中加入氯仿和异戊醇，体积比为25:24:1。无水乙醇和70%乙醇TE：0.01M Tris-HCl，0.001M EDTA，pH8.0。1TAE电泳缓冲液：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05 M EDTA，pH 8.0。 0.5TBE电泳缓冲液（1）取1.5mL6地表水样4000r/min离心10min，弃上清，加入500 L裂解液充分悬浮。（2）加入500L Tris饱和酚，混匀，室温放置10min，4000r/min离心10min。（3）吸取上层水相转移至新离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀后4000r/min离心10min。（若有必要，可重复操作一次。）（4）吸取上层水相转移至新离心管，加入两倍体积无水乙醇，充分沉淀后10000r/min离心10min，弃去上清液。（5）加入1mL 70%乙醇，充分悬浮后10000r/min离心10min，弃去上清液，晾干10min。加入50L TE溶解，得到细菌基因组DNA。（6）取10L 样品进行电泳检查（Marker为 DNA/Hind酶切），剩余样品-20保存。细菌16S rRNA基因V3区扩增取2.0 L 基因组DNA作为PCR模板，按照下表顺序和体积将反应液加入0.5mL的薄壁PCR管中，总体积50L。引物1：5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3引物2：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3表：试剂体积(L)终浓度模板2.0-引物1 (10 M)1.00.2 M引物2 (10 M)1.00.2 M10PCR Buffer （含Mg2+）5.0110 mM dNTPs1.00.2 mMTaq聚合酶1.02 Udd H2O39.0-总体积50.0-轻轻混匀并瞬间离心，放入PCR仪进行扩增，共35个循环。PCR反应条件：94，5min，预变性；94，1min变性；52，1min退火；72，3min延伸；72，5min，最后一次延伸。PCR总时间约3.5 h。PCR完成后取5L 样品进行电泳检查（Marker为DL2000），剩余样品-20保存。变性梯度凝胶电泳图谱分析微生物菌群30%丙烯酰胺储备液：含30%丙烯酰胺和0.8%亚甲双丙烯酰胺，避光保存于4。1TAE：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05 M EDTA，pH 8.0。10%过硫酸铵（APS）：0.1g APS溶于1.0mL水，-20保存一周。四甲基乙二胺（TEMED），去离子甲酰胺含变性剂8%丙烯酰胺凝胶溶液（现用现配）：低浓度变性剂：4.2mL 30%储备液+1.92mL去离子甲酰胺+2.016g尿素+9.9mL 1TAE；高浓度变性剂：4.2mL 30%储备液+3.84mL去离子甲酰胺+4.032g尿素+8.0mL 1TAE。（1）将丙烯酰胺储备液放置至室温，安装胶板和注射器等装置。（2）分别配制含30%和60%的变性剂的8%胶溶液各16mL。配置低浓度和高浓度变性的胶溶液各16mL加入比色管中，各加入14.4L的TEMED和144L的10%的APS，迅速混匀并吸入注射器中，终浓度0.09%。（3）用注射器吸取凝胶溶液装胶，各吸取16mL凝胶溶液，体积设置14.5mL。放上梳子，凝固1h。清洗吸取胶液的管子。（4）配制7L的1TAE并微波预热至60。（5）胶凝固后，将胶板安装至电泳装置。打开搅拌器设定60加热。（6）取出梳子，清洗上样孔。（7）关闭循环泵，上样。（8）160V电泳4h。（9）结束电泳，用0.5 mg/mL EB染色。（10）观察并拍照。注意事项：有缓冲液时再打开泵，液面应处于Fill与Max之间。不在仪器上压东西，或接触表面。加热管断电后继续搅拌3min，使加热管彻底冷却。平时把仪器放在支架上。加热管温度很高，应冷却后再接触。第二部分：细菌培养和菌落PCR实验原理：生物的分类等级包括界、门、纲、目、科、属、种等，还可以有亚纲、亚目、亚种等。核糖体是生物细胞内合成蛋白质的场所，由核糖体蛋白质和核糖体RNA（rRNA）组成。细菌核糖体沉降系数为70S，由50S和30S两个大小亚基组装而成。其中小亚基由16S rRNA和21种蛋白质组成，大亚基由5S rRNA、23S rRNA和至少31种蛋白质组成。核糖体广泛存在于所有生物细胞中，并且进化缓慢，变异较小，稳定性强。细菌的16S rRNA大约1.5kb，长度适中，被用于系统发育或分类鉴定。通常认为：16S rRNA序列同源性大于97%时是同一个种；若同源性低于97%，可以认为是同一属内的不同种；若同源性低于93%-95%，可能是属外成员。细菌16S rRNA序列分析方法包括：1）从新鲜菌体提取16S rRNA，提纯后用反转录酶和保守引物进行核苷酸序列的测定；2）扩增细菌基因组中16S rRNA基因，PCR产物直接测序；3） PCR产物与特定质粒连接后进行克隆和测序。实验步骤：牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、培养基配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g 琼 脂 20.0g蒸馏水 1000mL pH 7.0。2、操作步骤：（1）称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 （2）加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。（3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。（4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。（5）分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜灭菌后垂直待凝。 （6）加塞 试管口和三角瓶口塞上硅胶泡沫塞。（7）包扎 加塞后，可将若干支试管用牛皮纸扎在一起，并用绳子扎好。将三角瓶的硅胶泡沫塞外包一层牛皮纸。（8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37温室培养24h，无菌生长者方可使用。平板划线分离法先制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，用接种环以无菌蘸取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面有规则地划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其他形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线l2 次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。该法的特点是简便快速。菌落PCR扩增细菌16S rRNA基因（1） 从平板上挑取少许白色菌落，将其置于20L 双蒸水中，95100保温510 min。（2）将离心管15000 r/min室温离心5 min，取上清液作为模板进行PCR检测。引物F：5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3引物R：5-AAGGAGGTGWTCCARCC-3表：试剂体积(L)终浓度模板2.0-引物1 (10 M)1.00.2 M引物2 (10 M)1.00.2 M10PCR Buffer （含Mg2+）5.0110 mM dNTPs1.00.2 mMTaq聚合酶1.02 Udd H2O39.0-总体积50.0-轻轻混匀并瞬间离心，放入PCR仪进行扩增，共35个循环。PCR反应条件：94，5min，预变性；94，30s变性；56，40s退火；72，60s延伸；72，5min，最后一次延伸。PCR总时间约1.5 h。PCR完成后取5L 样品进行电泳检查（Marker为DL2000），剩余样品-20保存。（3）取适量扩增产物进行电泳分析。思考题：（1）实验操作过程中应注意哪些问题？（2）PCR-DGGE检测的基本原理是什么？（3）为什么要在上游5端添加GC夹？（4）变性剂尿素、甲酰胺的作用原理是什么？（5）PCR-DGGE分析微生物菌群实验中PCR扩增的是细菌的哪一段基因？为什么选择这段基因进行扩增？如何利用DGGE结果定量表征微生物的多样性？（6）制备培养基和接种细菌时需要注意什么问题？（7）利用16S rRNA进行细菌鉴定的原理是什么？参考文献：1J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂等译. 分子克隆指南(第三版). 北京：科学出版社，20032杨文博主编. 微生物学实验. 北京：化学工业出版社，20043张清敏主编. 环境生物学实验技术. 北京：化学工业出版社，20054陈德富，陈喜文主编. 现代分子生物学实验原理与技术. 北京：科学出版社，20065C. C. 马丁主编，杨军主译. 环境基因组学实验指南. 北京：科学出版社，2009附录1：Finnpipette可调式移液器使用说明1转动按钮设定移液量，顺时针转动移液量降低，逆时针转动移液量增加。将所要求的移液量调整到位，使数字完全出现在显示窗内。注意不能使移液量超过移液器使用范围，否则将造成移液器损坏。2确保洁净的管嘴牢固地装入移液器的管嘴嘴锥。将按钮压至第一停点位置，移液器管嘴置于液面以下23毫米深度并慢慢松开按钮，注意不能让按钮急速弹回。管嘴吸入液体后，将管嘴撤出液面并斜贴在试剂瓶壁上淌走多余的液体。3轻轻压下按钮至第一停点位置，约1秒钟后继续将按钮压至第二停点，排尽管嘴内的液体。缓慢松开按钮使之返回按钮起点位置。4将管嘴推顶杆下压，即可安全退去管嘴，然后将移液器竖直搁置在移液器支架上。附录2：琼脂糖凝胶电泳1 称取适量琼脂糖，加入1TAE或0.5TBE电泳缓冲液，琼脂糖浓度为1.0 %，微波炉加热熔化。2 待凝胶溶液冷却至约40时，加入EB溶液至终