马溪平---环境工程微生物实验讲义.docx

环境工程微生物实验讲义适用专业： 环境科学、环境工程主讲教师： 马溪平 辽宁大学教务处制二零一四年九月课 程 简 介 环境工程微生物学作为一门边缘学科，是运用环境工程的手段和方法来加速和强化自然界中污染物的循环、转化和降解，以充分发挥微生物降解、转化污染物的巨大潜力，实现环境工程的高效、稳定和资源的再生利用，消除人类活动对环境所造成污染的一门学科。它在改善人类的生存环境和消除环境污染中起到重要的作用。该课程要求学生要将理论与工程实践紧密结合，是一门实践性很强的课程。因此，大量的课程实验成为巩固和加深学生对基本知识和基本技能掌握与理解的必然要求。环境工程微生物学实验是环境工程、环境科学、环境监测等专业本科生的专业基础实验课。掌握必要的环境工程微生物学实验技能对于理解和认识环境工程微生物学的相关理论，从事环境工程的研究工作具有重要的意义。目 录实验一 水中溶解氧的测定1实验二 水中化学耗氧量COD的测定6实验三 生化需氧量BOD的测定15实验四 水中氨态氮的测定21实验五 水中总氮的测定26实验六 微生物脱酚测定31实验七 微生物脱氰测定39实验八 活性污泥性质的测定48实验九 污水中菌胶团和游离细菌的观察52实验十 污水中微型动物的观察和计数55实验十一 污水中鞘细菌的培养分离和纯化59实验十二 球衣细菌鞭毛染色和主要生理生化实验测定63实验十三 水质的细菌学检验68附 录77实验一 水中溶解氧的测定一、 实验目的及原理溶于水中的氧称为溶解氧(DO)。学习和掌握用碘量法测定DO的原理和方法。向水样中加入硫酸锰溶液和碱性碘化钾溶液，它们生成的氢氧化锰Mn(OH)2沉淀，迅速与水中溶解氧化合成锰酸MnO(OH)2，过量的氢氧化锰与锰酸作用生成锰酸锰MnMnO3。加入浓硫酸酸化，使已经化合的溶解氧（以锰酸锰形式存在）与溶液中的碘化钾起氧化作用后释放出碘，溶解氧越多，释放出碘也越多。最后用淀粉作指示剂，以硫代硫酸钠标准溶液滴定，可计算出水样中溶解氧的含量。反应式如下：4MnSO4+8NaOH4Mn(OH)2+4Na2SO4 （白色）2Mn(OH)2+O22MnO(OH)2或2H2MnO3锰酸（棕色）2H2MnO3+2Mn(OH)22MnMnO3+4H2O（棕色） 2MnMnO3+6H2SO4+4Kl2MnSO4+2I2+6H2O+2K2SO4I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6如水中有Fe3+、Fe2+、NO2、O2、SO42有机物严重污染对本法均有干扰。二、 实验用品及设备1试剂硫酸锰溶液称取分析纯硫酸锰（MnSO44H2O）48克溶于蒸馏水中，过滤不溶物，稀释至100亳升。碱性碘化钾溶液：称取分析纯或化学纯氢氧化钠100克，溶于6080亳升蒸馏水中，称取分析纯碘化钾30克，溶于40毫升蒸馏水中，待氢氧化钠溶液冷却后，将两溶液混合，并稀释至200毫升。此溶液贮于棕色瓶中。重铬酸钾标准溶液C（1/6K2Cr2O7）0.0250mol/L称取于105110烘干2h并冷却的优级纯重铬酸钾1.2258g，溶于水，移入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。硫代硫酸钠溶液称取分析纯硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）3.2克，溶于煮沸并放冷的蒸馏水中，加入0.2克无水碳酸钠，并稀释至1000ml。贮于棕色瓶中，使用前用0.0250mol/L重铬酸钾标准溶液标定，标定方法如下：于250ml碘量瓶中，加入100ml水和1g碘化钾，加入10.00ml0.0250mol/L重铬酸钾标准溶液、5ml（15）硫酸溶液、密塞，摇匀。于暗入静置5min后，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈淡黄色，加入1ml淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚好褪去为止，记录用量。（15）硫酸取分析纯，比重为1.84浓硫酸50毫升，徐徐加入250毫升蒸馏水中。1%淀粉指示剂称取1克可溶性淀粉，用少量蒸馏水在小烧杯中调成糊状，然后加入100毫升煮沸的蒸馏水，冷却后再加入0.125克水杨酸，以防止变质。2仪器250毫升溶解氧瓶（也可用250毫升无色小口试剂瓶代替）。250毫升碘量瓶。50毫升滴定管。移液管。250毫升三角瓶。三、 实验内容及步骤1用虹吸法取水样。使水样充满溶解氧瓶，盖紧玻璃瓶，如瓶壁有小气泡，应仔细敲击使气泡逸出。2取下瓶塞，用移液管插入瓶内液面以下，加入1毫升硫酸锰溶液。3再按同法加入3毫升碱性碘化钾溶液，盖紧瓶塞，此时亦应注意不使瓶中留有气泡。4将样瓶颠倒摇动数次，使加入的试剂与水样混合均匀。5静置数分钟后，至沉淀降至瓶中部，再颠倒摇动一次，使溶解氧得以固定。6待沉淀重新下降至瓶底时，用移液管沿瓶口插入液面下加入3毫升浓硫酸，盖紧瓶塞颠倒混合，使沉淀全部溶解，再于暗处静置5分钟。7用移液管取出100毫升静置后的溶液，放在250毫升的三角瓶中，用硫代硫酸钠溶液滴定至溶液颜色变为淡黄色时加入1亳升淀粉指示剂，继续滴直至蓝色刚好消失即为终点，记录硫代硫酸钠溶液用量。计算： 溶解氧O2毫克/升 式中：M硫代硫酸钠溶液浓度(mol/L)N滴定时消耗硫代硫酸钠溶液体积（ml毫升）注意事项：1水样中含有高铁时，在溶解氧的固定时，应加入0.51毫升30%氟化钾，以排除高铁的干扰。2水样中如有FeS2、SO42和有机物等还原性物质的污染应在测定之前，于溶解氧瓶内装满的水样中加入0.7毫升浓硫酸，再加入1毫升0.6N高锰酸钾溶液，盖紧瓶塞，颠倒摇动数次，水样保持淡红色5分钟以上，使还原性物质完全氧化。再加入1毫升2%草酸钾溶液，盖紧瓶塞，颠倒摇动。草酸钾溶液的用量恰好使高锰酸钾的红色消失为度。然后按步骤测定。3水样中如有NO2的污染，则应在碱性碘化钾溶液中加入叠氮化钠（NaN2），即可在配制碱性碘化钾时，每升碱性碘化钾溶液中加入10克叠氮化钠，测定仍按步骤进行。四、 实验思考题1水中溶解氧测定原理？测定方法？2计算你所测定的水中溶解氧含量？实验二 水中化学耗氧量COD的测定化学耗氧量重铬酸钾法（CODcr）一、实验目的及原理化学耗氧量（Chemical oxygen demand）是指一升水中还原性物质在一定条件下，被氧化时所消耗的氧的毫克数。水被有机物污染则耗氧量增加。因此化学耗氧量是体现水体被污染程度的标志之一。测定化学耗氧量有二种方法，即：高锰酸钾法和重铬酸钾法。高锰酸钾法操作简单，测定速度快，但氧化不完全。一般在测定严重污染的水样时，常采用重铬酸钾法。本实验目的为：了解测定COD的意义和方法；掌握重铬酸钾法测定COD的原理和方法。重铬酸钾在强酸性溶液中是强氧化剂，当加热煮沸时能较完全地氧化废水中的有机物及其它还原性物质。过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂。用硫酸亚铁铵回滴，由消耗的重铬酸钾量即可计算出水样中有机物质被氧化所消耗的氧的毫克/升数。Cr2O72+14H+6e2Cr3+7H2OCr2O72+14H+6Fe2+6Fe3+2Cr3+7H2O本法可将大部分有机质氧化，但直链脂肪族，芳香族化合物（苯氮苯等）仍不能被氧化；若加硫酸银作催化剂时，直链化合物可被氧化，但对芳香烃类仍无效。水样中氯化物高于30毫克/升时，对测定有影响，可加硫酸汞消除干扰。二、实验用品及设备1试剂重铬酸钾标准溶液（1/6K2Cr2O7=0.0250mol/L）称取预先在120烘干2h并冷却的优级纯重铬酸钾6.1290g，溶于水，移入500ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。试亚铁灵指示剂称取1.4850克邻菲罗啉（C12H8N2H2O，1，10）与0.6950克硫酸亚铁（FeSO47H2O）溶于蒸馏水中，稀释至100毫升，贮于棕色瓶内。硫酸亚铁铵标准溶液（NH4）2Fe（SO4）26H2O0.1mol/L称取39.5克硫酸亚铁铵（NH4）2Fe（SO4）26H2O溶于蒸馏水中，边搅拌边缓慢加入20毫升浓硫酸，冷却后稀释至1000mL。使用时用重铬酸钾标定。标定：准确吸取10.00毫升重铬酸钾标准溶液，加入500毫升三角瓶中，加蒸馏水稀释至110毫升左右，缓慢加入30毫升浓硫酸，混匀。冷却后加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。浓硫酸（分析纯）硫酸银（化学纯）硫酸汞（化学纯）2仪器容量瓶（1000ml 100mL）三角瓶（500ml 250m）移液管，大肚移液管回流冷凝装置一套（冷凝管一支，250毫升圆底烧瓶或三角烧瓶一只）三、实验内容及步骤1吸取50毫升水样（或适当水样稀释至50毫升）于500毫升磨口三角瓶中（或者圆底烧瓶），加入15.00毫升重铬酸钾标准溶液，再徐徐加入65毫升浓硫酸使混合液中硫酸浓度约为50%，边加边摇动，使其充分混合，再加0.1克硫酸银，再放入几粒玻璃珠，加热回流二小时，若水样较清洁，回流时间可缩短一些。若水样中含有较多的氯化物，则取50mL水样加硫酸汞1g，浓硫酸5mL，待硫酸汞溶解后，再加重铬酸钾溶液25.00mL，硫酸银1g，加热回流。2冷却后先用约25毫升蒸馏水沿冷凝管壁冲洗，随后取下烧瓶。将溶液移入500毫升三角瓶中，冲洗烧瓶45次，再用蒸馏水稀释至溶液约为350毫升，溶液体积不得少于350毫升，因酸度太大终点不明显。3冷却后加入23滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定至溶液由黄色到绿蓝色变为红蓝色。记录所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液的毫升数（V1）。4同时要做空白试验，即取50毫升蒸馏水，测定步骤与水样完全相同，记录所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液毫升数（V0）。计算： 化学耗氧量O2毫克/升 式中： C硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（mol/L） Vo空白所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液用量（ml） V1水样所消耗的硫酸亚铁铵标准溶液用量（ml） V水样体积（ml）注意事项：1向水样及空白试验中加各种试剂时，应按同一次序加入。2试亚铁灵指试剂不宜加入过早，因溶液未全冷却就加入指示剂，指示剂易被破坏，而影响实验结果。3加热回流时，若溶液由黄色变为绿色，说明水样太浓，重铬酸钾量不够，须另取水样，稀释后重新测定。化学耗氧量高锰酸钾法（Condemn）一、实验目的及原理了解测定COD的意义和方法；掌握高锰酸钾法测定水中COD的原理及方法。高锰酸钾在酸性溶液中，能将还原性物质氧化，但当加热时间较短时，往往不易将有机氮化合物分析，故耗氧量只能用来大概表示有机物的含量而不能全面反映被有机物污染的程度。在水样中加放一定量的标准高锰酸钾KMnO4溶液，在酸性条件下加热，水中的还原性有机物与无机物质与高锰酸钾作用。MnO4+8H+5eMn2+4H2O水样中的污染物质，被高锰酸钾氧化后，过量的高锰酸钾可加入草酸予以还原。2MnO4+5C2O2216H+2Mn28H2O16CO2而过量的草酸还可以用高锰酸钾返滴定。总的反应式为：2KMnO45H2C2O43H2SO4K2SO42MnSO4+8H2O+16CO2由高锰酸钾及草酸的用量可以算出被水样中还原性物质所消耗的高锰酸钾量。二、实验用品及设备1试剂0.1N高锰酸钾溶液称取3.2克分析纯高锰酸钾于蒸馏水中，煮沸1015分钟，在水溶上保持一小时，冷却后移入容量瓶中，稀释至一升，静置710天，然后用虹吸管将上部澄清液移注于棕色试剂瓶中，放置暗处保存。0.01N酸性高锰酸钾溶液取0.1N高锰酸钾溶液以蒸馏水稀释10倍而成，临用时按测定步骤所示用0.0100N草酸或草酸钠溶液标定其准确浓度。0.100N草酸或草酸钠标准溶液取预先在烘箱中180烘至恒重的分析纯草酸钠0.6701克，置于100毫升溶量瓶中，加蒸馏水稀释至8090毫升。振荡使之完全溶解，然后以蒸馏水稀释至刻度，充分混合，置于暗处保存。浓度有效期为一个月。用草酸配制时，则可称取0.6321克分析纯草酸按上法配制。0.0100N草酸或草酸钠溶液取0.100草酸或草酸钠溶液以蒸馏水稀释成10倍而成。置于暗处保存，浓度有效期为一周。1.3硫酸溶液：取一个体积浓硫酸于三个体积蒸馏水中，加入高锰酸钾溶液氧化杂质，煮沸半小时，并使溶液呈淡红色为止。2仪器量筒或大肚移液管（100毫升）三角瓶（250毫升）酸碱式滴定管玻璃珠煤气喷灯三、实验内容及步骤1测定水样的量。须根据有机物的含量而定，一般测定未受严重的湖、河水的化学耗量时，水样可不必稀释，清洁透明水取100毫升，制定工业废水化学耗氧量时，一般需经适当稀释至100mL。将水样放入250mL三角瓶中。2加入5毫升1：3硫酸溶液，再用滴定管准确加入10毫升0.01N高锰酸钾溶液（设加入量为V1）并投入几颗玻璃珠，放入蒸汽炉上大火加热使之迅速沸腾。从开始煮沸起（以冒出第一个大气泡开始算起）煮沸10分钟（注意三角瓶内玻璃珠情况，如突然停止跳动可能产生骤沸现象，骤沸时样品冲出会使实验报废。故遇到玻璃珠停止跳动时需摇动三角瓶，防止骤沸情况发生）。3煮沸十分钟后取下三角瓶，趁热自滴定管加入10.00毫升0.01N草酸溶液或草酸钠溶液，振荡均匀，此时过量的高锰酸钾因还原而红色完全消失。4待温度降至6080，自滴定管加0.01N高锰酸钾溶液至微红色即为终点。记录用量V2。50.01N高锰酸钾溶液的标定，可在同一三角瓶中进行，当上述滴定完毕后趁热加入10.00毫升0.0100N草酸或草酸钠溶液，立即以高锰酸钾溶液滴定至微红色，记下高锰酸钾溶液用量V2。如高锰酸钾溶液度是准确的0.01N，则滴定时用量应为10.00毫升，否则需求得一校正系数（K）。K V2滴定10毫升0.01N草酸或草酸钠时高锰酸钾用量（毫升）计算：化学耗氧量O2毫克/升 式中：V1沸腾时加入水样的高锰酸钾溶液用量（毫升） V2最后滴定比高锰酸钾溶液用量（毫升） K0.01N高锰酸钾校正系数0.0181毫升0.01N高锰酸钾溶液相当氧的毫克数。 V最初取的水样体积注：采用蒸馏水稀释水样测定时，因一般蒸馏水中含有若干还原剂，所以，必须另取蒸馏水进行耗氧量测定，测定方法同上。取100毫升蒸馏水按上述步骤测定时设高锰酸钾溶液滴入量为V0毫升，则应按下列公式计算：式中C表示稀释水样中所含蒸馏水的比例，如10毫升水样，加90毫升蒸馏水则C0.9注意事项：1为得到比较可靠的结果，实验中各种条件应尽可能保持一致，如：试剂浓度，试剂加入量反加入次序，煮沸方式和煮沸时间等。2水样稀释倍数和取水样的体积，要求在测定中用高锰酸钾溶液；达滴定时所消耗的高锰酸钾溶液在46毫升之间，消耗量过大或过小，都应重新稀释或重新取样。3在加热过程中，（溶液应保持红色，如红色很浅或全部退去）说明水样太浓，有机物质含量过多，高锰酸钾用量不够，应将水样重新稀释后再进行测定。四、实验思考题1何为化学耗氧量？测化学耗氧量有何意义？2用重铬酸钾法（CODcr）测定化学耗氧量原理和方法？3用高锰酸钾法（CODMn）测定化学耗氧量原量和方法？4测定化学耗氧量要注意哪些问题？5报告测定结果。实验三 生化需氧量BOD的测定一、 实验目的及原理生物需氧量（biochemical oxygen demand）简称BOD。是指一升含有机物的水中，在有氧条件下，由于水中好气性微生物的作用。使有机物完全氧化时所需要溶解氧的量，一般用需氧的毫克数表示（O2毫克/升）。微生物分解有机物需要一定时间。且分解速度随湿度而异。目前国内外均以20下在有充分溶解氧存在时，1升水培养五天所需要的氧作为指标，所以用BOD5表示。生化需氧量（BOD5）的大小可以用来衡量水被污染的程度。从而可以研究处理的方法。废水经过处理后，根据生化需氧量的数值，可以说明处理效果。所以生化需氧量在废水处理中也是经常测定的，具有指导意义的指标之一。本实验目的在了解生化需氧量（BOD5）的含义；掌握五日培养法测定生化需氧量的基本原理和方法；复习碘量法测定DO的操作技术。测定水样在培养前的溶解氧和在201培养5天后的溶解氧两者之差即为生化需氧量BOD5，水中有机物越多，BOD5也越大，但因水中溶解氧有限，生化需氧量就会超过水样中所含有的溶解氧量，因此在培养前，需要用含有一定营养成份的饱和溶解氧的水（称稀释水）将水样稀释，然后再进行培养。在具体工作中，水样究竟要稀释多少倍，这就需要根据几次实验探索所得经验，再确定稀释倍数。先测定稀释水样当天的溶解氧。另外几个同样稀释的水样，放在20培养箱中，培养5天，然后再测定其溶解氧。溶解氧的测定仍用碘量法。二、实验用品及设备1.试剂硫酸锰溶液碱性碘化钾溶液硫代硫酸钠溶液浓硫酸比重1.841%淀粉指示剂以上备用试剂的配制同测定溶解氧方法。磷酸缓冲液、称取化学纯磷酸氢二钾（k2HPO4）21.75克，化学纯磷酸二氢钾（kH2PO4）8.5克，化学纯磷酸氢二钠（Na2HPO47H2O）33.4克，化学纯氯化铵（NH4Cl）1.7克，溶于蒸馏水中，并稀释一升。此缓冲液的PH7.2。硫酸镁溶液称取化学纯硫酸镁（MgSO47H2O）22.5克溶于蒸馏水中。并稀释至1升。氯化钙溶液称取化学纯氯化钙（CaCl2）27.5克，溶于蒸馏水中，并稀释至1升。三氯化铁溶液称取化学纯三氯化铁（FeCl36H2O）0.25克，溶于蒸馏水中，并稀释至1升。稀释水在20升大玻璃瓶中加入18升蒸馏水，按每升水中加入上述四种试剂各1毫升（试剂）曝气12天，（冬天曝气时间可缩短）使溶解氧量在8毫克/升以上，达到饱和状态。PH应在7.28之间，可用氢氧化钠溶液或盐酸调节。稀释水中要有发生生化过程的微生物，一般受生活污水污染或未经高温过程及含毒量不高的工业废水中都含有此类微生物，否则应在稀释水中加入一些生活污水。作为微生物的接种。除此之外稀释水的五天生化需氧量应不大于0.2毫克/升。2仪器 溶解氧瓶（250毫升） 三角瓶（250毫升） 滴定管（50毫升） 移液管 玻璃瓶（20升） 量筒、容量瓶（1000ml） 抽气泵或抽气管 恒温培养箱（201）三、实验内容及步骤1首先必须稀释水样，水样稀释倍数需根据培养后减少溶解氧量而定。一般要同时做35个不同的稀释倍数。以便选择溶解氧减少在4070%之间的水样作为计算生化需氧量的数据。稀释水样的方法。按稀释比用移液管分别移取一定体积的水样于1000毫升量筒内，再以虹吸法沿量筒壁加入稀释水到满刻度，并用特制的下端带有橡皮板的玻璃棒上下轻轻搅动，使水样稀释。但应特别注意避免曝气。2水样经稀释后，用虹吸法沿瓶壁将稀释的水样注满碘量瓶（溶解氧瓶也可）轻击瓶体。务必使瓶内不得留有气泡，盖上瓶塞，每一个稀释倍数应装两瓶。其中一瓶用来测定当天的溶解氧，另一瓶放培养箱内在20度培养5天后。再分别测定不同稀释倍数的水样的溶解氧。3另用虹吸法沿瓶壁将稀释水（不加水样）注满两只溶解氧瓶，操作同上，作为空白，其中一瓶用来测定当天溶解氧，另一瓶与稀释的水样一起培养五天后，再测其溶解氧。计算：BOD5（O2毫克/升）式中：D1和D2分别为经稀释的水样在培养前和培养后的溶解氧浓度（ml/L）B1和B2分别为稀释水的培养前和培养后的溶解氧浓度（ml/L）f1为稀释水在培养液中占的比例f2为水样在培养液中所占的比例当稀释倍数超过100时，可按下式计算BOD5（O2毫克/升）（D1D2）（B1B2）a式中a为稀释倍数。注意事项：1稀释倍数是否恰当是成败的关键，可检查培养后样品中溶解氧应不少于34毫克/升，培养期间氧的消耗亦不应少于34毫克/升，溶解氧的减少以4070%为度。2一般需要同时做35个稀释倍数，选用符合上述条件的作为计算水样生化需氧量的依据。稀释倍数的范围一般都是根据化学耗氧量COD的测定结果，结合废水的实际情况和操作经验来确定。对工业废水来说大致要稀释1001000左右。对处理较完全的废水大致要稀释1050倍左右，根据上海市城建局排水管理所化验室的经验，稀释倍数的确定可以大概从高锰酸钾耗氧量测定结果，同时参考溶解氧数据来推算，其方法如下：清洁地面水或轻度污染地面水：耗氧量溶解氧 稀释倍数（0.20.5）耗氧量生活污水：无溶解氧 稀释倍数2.5耗氧量污水厂出水工业废水：无溶解氧 稀释倍数0.2耗氧量3稀释水的温度尽量保持在20左右，冬季如低于20应预热，夏季高于20应冷却，否则与培养温度（201）相差太大往往容易使溶解氧过高或过低而使试验失败。四、实验思考题1何为生物化学需氧量BOD5？测定生化需氧量有何意义？2测定生化需氧量原理是什么？3测定生化需氧量的方法？4测定生化需氧量应注意哪些问题？5测定结果？实验四 水中氨态氮的测定一、 实验目的及原理水体的有机化合物中。以氮化物为最不稳定，易受微生物氧化作用。成为简单的无机氮化物。若水体中有氧时，有机氮化物经微生物生物氧化作用，释放出氨。氨可被微生物进一步氧化，逐步转化为亚硝酸盐或销酸盐。有机氮化物逐渐转为氨、亚硝酸盐及硝酸盐的情况表示了水体净化的程度，水中存在氨氮，则表示水中的有机氮化物正在分解。若氨氮很高，则表示不久前受过严重污染。本实验目的在于：学习和掌握用氢氧化钠滴定法测定水中氨态氮的原理和方法在工业废水中，氨氮是以游离状态和铵盐的形式存在的，在碱性溶液PH7.4时，铵盐被分解，析出游离氨。因此在水样中加入磷酸缓冲液，使PH提高到7.4左右，加热蒸馏水样将氨蒸出并收集于一定量的已知浓度的硫酸标准溶液中，则氨与一部分硫酸作用生成硫酸铵。2NH3H2SO4(NH4)2SO4过量的硫酸标准溶液再以氢氧化钠标准溶液进行滴定。H2SO42NaOHNa2SO42H2O二、 实验用品及设备1.试剂无氨蒸馏水磷酸盐缓冲液（PH7.4）称取分析纯或化学纯磷酸二氢钾（kH2PO4）7.15克，分析纯或化学纯磷酸氢二钾（K2HPO4）48.05克，溶于少量无氨蒸馏水中，并稀释至500毫升。硫酸标准溶液（1/2H2SO4=0.020mol/L）移取分析纯浓硫酸（比重1.84）5.6毫升，溶于无氨蒸馏水中，并稀释至1升，此溶液浓度为0.20mol/L。如将此溶液稀释10倍，成0.020mol/L。使用时可标定：标定：将分析纯无水碳酸钠放在180烘箱中，烘二小时使之干燥，精确称取干燥的无水碳酸钠0.5克（称准至0.0001g），溶于蒸馏水中，移入500ml容量瓶中，稀释至标线。移取25.00ml碳酸钠溶液于150ml锥形瓶中，加25ml水，加2滴甲基橙指示剂，用硫酸溶液滴定至溶液颜色由黄转为淡橙红色为止，记录硫酸溶液用量。式中：52.9951/2碳酸钠摩尔质量（g/mol）经过标定的硫酸溶液，再用无氨蒸馏水准确稀释至浓度为0.020mol/L。氢氧化钠标准溶液称取分析纯氢氧化钠0.8克，溶于无氨蒸馏水中，并稀释至1升，此溶液的浓度为0.020mol/L。标定：精确移取上述氢氧化钠溶液25.00ml。注入250毫升三角瓶中。加入数滴酚酞指示剂。以0.020mol/L硫酸标准溶液滴定，至红色消失为止。记录硫酸标准溶液用量。再将此溶液校正浓度至0.020mol/L甲基橙指示剂称取0.1克甲基橙溶于蒸馏水中，并稀释至100毫升。甲基红指示剂称取0.1克甲基红溶于95%乙醇中，并稀释到100毫升。酚酞指示剂称取0.1克酚酞，溶于95%乙醇中，并稀释至100毫升。2.仪器 开氏烧瓶（250毫升） 酸式和碱式滴定管（50毫升） 定氮球 冷凝管 三角瓶 大肚移液管，一般移液管 容量瓶（1000毫升、100毫升） 电炉子（或电热套）三、实验内容及步骤1取振荡均匀的水样100毫升，放入开氏烧瓶内，加无氨蒸馏水至250毫升，并加入磷酸盐缓冲液10毫升。2接好定氮球和冷凝管，并将蒸馏液导管引入三角瓶内，三角瓶内预先加好0.020mol/L硫酸溶液10毫升及68滴甲基红指示剂，蒸馏液导管出口插入液面下。 3通冷凝水进行蒸馏，当蒸出200毫升时，将导管从硫酸溶液中取出，继续蒸馏几分钟，使导管内壁得到冲洗，然后停止蒸馏。4收集的蒸馏液用0.020mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，至由橙红色变为黄色为止。记录用量。(a-b)N141000水样体积（毫升）计算：氨氮（N，mg/L）式中：a收集瓶中硫酸标准溶液相当于氢氧化钠标准溶液的毫升数b滴定时所耗氢氧化钠标准溶液体积（毫升）N氢氧化钠标准溶液的浓度注意事项：1蒸馏仪器的密闭性要严格，否则会在蒸馏过程中使氨挥发损失。2在蒸馏过程中应随时注意吸收液的颜色，当红色变浅甚至可能变黄，而使氨吸收不完全时，则应马上追加10ml硫酸标准液，如已变黄则氨可能已有损失而应重做。3当某些工业废水有部分干扰物质蒸出而影响滴定时，可在滴定前加热煮沸305分钟，冷却后再行滴定。4当氨氮含量较低时，本法不够灵敏，可将蒸出液用纳氏试剂比色测定。四、实验思考题1测定氨氮的原理？2测定氨氮方法和应注意的问题？3测定结果？实验五 水中总氮的测定如果工业废水（石油、煤气、皮草、生物制品厂等）中含有较多的含氮化合物，这样的废水排入水体，可以使藻类等生物大量繁殖，造成水体缺氧，此种情况称为水体的营养污染，造成水域的富营养化。会给国家经济带来重大损失。一、 实验目的及原理总氮包括有机氮、氨氮、硝态氮、亚硝态氮。地面水和地上水中含氮物质来自农田的氮肥（尿素、硝酸盐、铵盐等），生活污水和含有氮的工业废水。水中含氮化合物的转化过程大致如下：RCHNH2COOHH2ORCHOHCOOHNH3游离的氨或铵盐在有氧的情况下，经过细菌的氧化作用。逐步变成亚硝酸盐和硝酸盐。2NH33O22HNO22H2O2HNO2O22HNO3本实验目的在于：了解水中总氮的测定意义和原理；掌握水中总氮的测定方法。水中有机氮在以硫酸铜为催化剂，加浓硫酸消解变成硫酸铵。NH2CH2OH2H2SO4NH3CO22SO23H2ONH3H2SO4（NH4）2SO4在消解过程中，加入水杨酸使硝态氮变成硝基水杨酸固定下来，亚硝酸盐和硝酸盐就不会损失。加入硫化硫酸钠使其还原为氨基化合物，在浓硫酸作用下分解，最后变成硫酸铵。其反应式如下：C6H4（OH）COOHHNO2C6H3（OH）（NO2）COOHH2ONa2S2O3H2SO4H2SO4SNa2SO3C6H2（OH）（NO2）COOH3H2SO4H2O3H2SO4C6H3（OH）NH2COOHC6H3（OH）（NH2）COOH13H2SO4NH27CO213SO215H2O消解时，加入硫酸钾提高沸点，加入硫酸铜促使硫酸在消解过程更快地氧化有机质。开始分解时，由于有机质碳化，分解液呈黑色，当分解完毕时，碳全部氧化成二氧化碳，分解液则呈淡绿色（呈硫酸铜颜色）。消解后的水样中加入氢氧化钠溶液使成碱性，蒸出氨，用已知过量的硫酸标准溶液吸收蒸出的氨，并与之化合物生成硫酸铵。（NH4）2SO42NaOHNa2SO42H2O2NH32NH3H2SO4（NH4）2SO4过量的硫酸再以氢氧化钠标准溶液滴定。二、实验用品及设备1试剂浓硫酸 分析纯 比重1.84水杨酸 分析纯硫酸钾 分析纯硫酸铜 分析纯50%氢氧化钠溶液称取分析纯或化学纯氢氧化钠100克，溶解于蒸馏水中，并稀至200毫升，静置使碳酸钠沉淀，倒出上清液，储于带有橡皮塞的瓶内。甲基红指示剂称。称0.1克甲基红溶于100毫升95%乙醇中硫代硫酸钠，分析纯0.02N硫酸标准溶液取分析纯硫酸5.6毫升，用无氮蒸馏水稀释一升，再稀释10倍即得0.02N硫酸溶液，标定方法见实验四。0.02N氢氧化钠标准溶液称取0.8克分析纯氢氧化钠溶于无氨蒸馏水中，并稀释至一升，0.02N硫酸标准溶液标定。2仪器开氏烧瓶（800毫升）蒸馏装置一套容量瓶（1000毫升）量筒三角瓶 式滴定管 煤气炉三、实验内容及步骤1取100毫升水样于开氏烧瓶内，加0.30.5克水杨酸10毫升浓硫酸，加热蒸发至体积约为30毫升，冷却。2取下开氏烧瓶加入0.30.5克硫代硫酸钠，加热至黄色硫析出，并有硫化氢产生。继续加热到没有臭气，同时瓶口有二氧化硫白烟冒出，瓶底出现黑色炭粒，停止加热并冷却。3加硫酸钾12克，加硫酸铜0.2克，继续加热至溶液呈黄绿色。4停止加热，待完全冷却后徐徐加入250毫升无氨蒸馏水，并沿瓶口加入75毫升50%氢氧化钠溶液，不要振荡开氏烧瓶，此时氢氧化钠因比重大而留在瓶的下部。5立即把开氏烧瓶与氮球及冷凝管接好（防止漏气）并将蒸馏液导管插入收集瓶的硫酸溶液内，予先在收集瓶中加好10毫升0.02N硫酸标准溶液及4滴甲基红指示剂。6用力振荡开氏烧瓶，此时瓶内应生成绿蓝色或灰色沉淀物Cu(OH)2。如无沉淀物则须适当增加氢氧化钠溶液，接好开氏烧瓶和冷凝管，加热蒸馏，约蒸出200毫升，从三角瓶中取出导管，再蒸馏下，并用蒸馏水冲洗导管外部，将冲洗液一起收集于三角瓶中。7取下三角瓶。用氢氧化钠标准溶液滴定，至溶液呈黄色为止。记录用量。(a-b)N141000V计算：总氮N毫克/升式中：a收集瓶中所加硫酸标准溶液相当氢氧化钠标准溶液的毫升数b滴定时氢氧化钠标准溶液用量（毫升）V水样体积N氢氧化钠标准溶液的当量浓度注意事项：1加入硫代硫酸钠后有硫化氢和二氧化硫产生。硫化氢气体有毒，须注意加入硫代硫酸钠后不能立即加硫酸铜，一定要将硫化氢气体赶走后才能加硫酸铜和硫酸钾，不然会生成黑色的硫化铜沉淀，以至增加分解时间，并而容易崩爆。2加入浓氢氧化钠之前，一定要将氮球，冷凝管及收集蒸馏液的三角瓶装好。氨易挥发应立即蒸馏，以免损失，影响结果的准确性。3如在蒸馏过程中产生崩爆现象，必须停止蒸馏。4在蒸馏过程中，如果收集瓶中的溶液变成黄色，说明硫酸量不够中和蒸出氨气，此时应增加收集瓶中硫酸用量或稀释水样后重新进行测定。5硫酸钾用量不宜过多，因温度过高生成硫酸氢铵也会分解，放出氨使氮受损失。四、实验思考题1何为总氮？测总氮有何意义？2测定总氮原理是什么？3测定总氮方法，要注意哪些问题？4测定结果？实验六 微生物脱酚测定一、 实验目的及原理酚是芳香烃的衍生物，在芳香核上含有羟基（OH）的化合物称为酚类化合物或酚。酚的污染主要来自煤气厂、焦化厂、石油化工厂、煤油厂等排放的废水。在各种酚类中，挥发酚的毒性最大，特别是被挥发酚污染的水源，其水不能饮用。在自然界中有些微生物具有降解酚的能力。在好气条件下将酚最终分解成二氧化碳和水。本实验目的在于：掌握计算微生物脱酚率的方法；学习和掌握溴化容量法、四氨基安替比林比色法测定酚的浓度的原理和方法。往含酚的培养基中接入脱酚菌，在好气振荡条件下培养24小时。细菌将培养基中的酚降解，使培养基中酚浓度降低。测定培养前和培养后酚浓度之差，就可计算出细菌脱酚率。测定酚的方法有溴化容量法和四氨基安替比林比色法。二、实验用品及设备1溴化容量法硫代硫酸钠标准溶液配制和滴定方法见溶解氧的测定（1+3）硫酸溶液量取化学纯浓硫酸（比重1.84,98%）50毫升徐徐加入150毫升蒸馏水中。0.025mol/L溴液称取分析纯溴化钾2.25克，分析纯溴酸钾0.7克溶于蒸馏水中，并稀释至1升。10%硫酸铜溶液称取化学纯硫酸铜10克，溶于蒸馏水中，并稀释至100毫升。10%碘化钾溶液称取分析纯碘化钾10克，溶于少许蒸馏水中，并稀释至100毫升。淀粉指示剂称1克可溶性淀粉，用少量蒸馏水在烧杯中调成糊状，然后用煮沸的蒸馏水稀释至100毫升，并加入0.125克水杨酸，以防分解变质。24氨基安替比林比色法苯酚的标准溶液精确称取重蒸酚1.000克（用称量瓶于万分之一开秤称量）。溶于100毫升饱和四硼酸钠溶液中，然后倒入1升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇均。取此溶液10毫升，移至另100毫升的容量瓶中，再用蒸馏水稀释至刻度，摇均。此溶液为每毫升含苯酚0.1毫克。氯化铵氢氧化铵缓冲液称取化学纯氯化铵20克，溶于100毫升氢氧化铵中。2%4氨基安替比林溶液称取分析纯4氨基安替比林2克，溶于蒸馏水中，并稀释至100毫升。置于棕色瓶内，可使用两周。铁氰化钾溶液称取化学纯铁氰化钾8克，溶于蒸馏水，并稀释至100毫升。置冷暗处存放。可使用两周。10%碳酸铜溶液配制同溴化法9N硫酸溶液配制同溴化法。3葡萄糖蛋白胨培养液葡萄糖 1克蛋白胨 0.5克磷酸氢二钾 0.1克硫酸镁 0.05克水 1000毫升PH 7.27.4量取上述培养基100毫升，于500毫升三角瓶中，塞好棉塞，再包上报纸。于0.8公斤压力下灭菌30分钟。（1）1毫克/毫升酚精确称取重蒸酚1克，溶于1000毫升蒸馏水中，再经除菌漏斗抽滤除菌，储存冰箱中。（2）A10； A11斜面脱酚菌种4.仪器（1）碘量瓶（250毫升）（2）蒸馏瓶（500毫升）（3）冷凝管（4）三角瓶（500毫升、250毫升）（5）容量瓶（1000毫升、500毫升、250毫升、100毫升）（6）大肚移液管（50毫升、10毫升、5毫升）（7）移液管（10毫升、5毫升、2毫升、1毫升）（8）滴定管（50毫升、微量滴定管）（9）无菌移液管（10毫升、5毫升、2毫升、1毫升）（10）接种环（11）煤气灯（12）乳胶管（13）721型分光光度计（50毫升比色管）（14）真空泵（15）除菌漏斗（96）（16）抽滤瓶（17）坐标纸、直尺（18）摇床三、实验内容及步骤以无菌操作手续取一定量脱酚菌种接入已灭菌的盛有100毫升培养液的500毫升三角瓶中，做一个重复。另取两瓶不接菌做对照，置摇床上恒温38振荡培养24小时，取出后再以无菌操作手续往每一个培养瓶里加5毫升含有1.00毫克/毫升酚溶液，使培养瓶里的培养液含酚500毫克/升左右。对照瓶亦加同量的酚溶液，再置摇床上恒温38振荡培养24小时，取出测酚的浓度。培养前和培养后酚的浓度差即为该菌的脱酚率。为求实验的准确性，可用不接菌对照瓶校正，即减去酚的挥发率。酚的鉴定可用溴化容量法和四氨基安替比林比色法，当水中挥发酚的浓度比较大时，用溴化容量法，当挥发酚浓度比较小时，一般1毫克/升以下可用四氨基安替比林比色法测定。1溴化溶量法（1）原理用过量的溴将酚溴化，然后用碘量法测定过量的溴。在酸性条件下，溴酸盐与溴化钾反应生成溴。KBrO35KBr+3H2SO43Br2+3H2O3K2SO4溴再与酚发生取代反应，生成溴代酚。如溴和苯酚作用生成溴代三溴酚。加入碘化钾使之与多余的溴液起作用，析出碘。Br2+2KI2KBr+I2 同时碘化钾也与溴代三溴酚作用，生成三溴酚，并析出碘。由此可见，加入碘化钾后溴化反应的最终产物为三溴酚，每个苯酚分子与6个溴原子反应，故苯酚的当量应为溴分子量的六分之一。最后用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘。2Na2S2O3+I22NaI+Na2S4O6从溴的用量可以计算出酚的含量。（2）测定步骤取测定样（摇床培养液）50毫升，放入500毫升蒸馏烧瓶中，用大肚移液管加入10%硫酸铜溶液10毫升，（1+3）硫酸溶液10毫升，再加蒸馏水200毫升，进行蒸馏，蒸馏液收集于250毫升容量瓶中，蒸出的馏液达到200亳升时，停止蒸馏。用蒸馏水稀释至刻度。取50毫升蒸馏液于250毫升碘量瓶中，加入0.025mol/L溴液25毫升，再加（1+3）硫酸溶液10毫升，迅速盖紧瓶盖，放置30分钟，使其进行溴化反应。再加入10%碘化钾溶液10毫升，再置暗处放置10分钟，使碘全部析出。用0.0250mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色时，加入淀粉指示剂数滴，继续滴定至蓝色消失为终点。取与测定样蒸馏液同体积的蒸馏水于250毫升碘量瓶中，作空白试验，其操作步骤与测定样完全相同。（3）计算：式中：a空白试验所耗硫代硫酸钠标准溶液（亳升）b50毫升测定样蒸馏液所耗硫代硫酸钠标准溶液（毫升）V摇床培养液体积15.67苯酚的当量0.0250硫代硫酸钠标准溶液的当量浓度（4）注意事项：酚与溴作用时间的长短，过量溴的多少，以及溴化温度对测定都有影响，因此每次测定应尽可能控制一致，溴化温度在室温或低于室温时，侧链的作用很慢，反应正常。如高于室温，则产生过分溴化，使结果偏高。溴过量不能太多，一般119.9毫克溴能溴化24毫克酚。否则会造成过量溴化使结果偏高，也使溴液失散。24氨基替比林比色法（1）原理4氨基安替比林和酚类化合物在碱性溶液中，和氧化剂铁氰化钾作用，生成红色的安替比林染料。和标准管比色，可测出水样中酚的含量。生成的色度在水中能稳定约30分钟，若用氨仿萃取，可使颜色稳定4小时，并能提高测定灵敏度。本法可测定含酚范围为0.210毫克/升（2）绘制酚溶液的标准曲线取50毫升比色管7友，分别加入苯酚标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0毫升，加入蒸馏水稀释至50毫升，再加入2毫升氯化铵一氢氧化铵溶液，加入1毫升4氨基安替比林溶液，混均后再加入1毫升铁氰化钾溶液，再彻底混均，放置15分钟后，于510毫微米波长以试剂为空白，于721分光光度计测定光密度，以光密度为纵坐标，以酚的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。（3）测定步骤取测定样（摇床培养液50毫升，加入500毫升蒸馏烧瓶中进行蒸馏）、（蒸馏方法和步骤完全同溴化法）。取50毫升蒸馏液，放入比色管中，加入2毫升氯化铵 氧化铵缓冲液，1毫升4氨基安替比林溶液，混均，再加入1毫升铁氰化钾溶液，彻底摇均。放置15分钟后，以试剂为空白。510毫微米波长，放721型分光光度计测定光密度。（4）计算： 细菌脱酚率的计算：四、实验思考题1细菌脱酚实验原理？2用溴化容量法测酚原理，及测定方法？3用4氨基安替比林比色法测酚原理，及测定方法？4计算脱酚结果？实验七 微生物脱氰测定一、 实验目的及原理氰化物在水体中存在的形式是多种多样的，有简单的盐类、如钠、钾、铵盐等，溶解度大，毒性很强。也有复盐，如铜、锌、铁等络合物，其化学性质和毒性也各不相同。虽然络合氰化物的毒性比简单的氧化物小，但由于能分解出氰离子，故仍有毒性。氰化物对机体的毒性作用是氰离子与含铁细胞色素氧化酶结合，妨碍细胞正常呼吸，因而使组织缺氧，机体陷入窒息状态。如长期饮用微量氰化物的水，将会引起甲状腺肿大。因此水中含微量氰化物对公共卫生，水生生物活动，河流的净化等均有重要的影响。本实验目的在于：了解水中氰化物对环境的危害；学习和掌握硝酸银容量法、吡啶联苯胺比色法测氰的原理和方法。在自然界中有一些微生物可分解氧化物在好气条件下将氰最终分解成二氧化碳和水。 NH3NO2NO3HCHCHO HCOOHCO2H2O往含氰的培养基中接入脱氰菌，在好气振荡条件下，恒温38培养24小时，则微生物将培养基中的氰降解，培养基中浓度降低，测定培养前和培养后氰浓度之差，就可以计算出细菌脱氰率。二、实验用品及设备1硝酸银容量法（1）15%酒石酸溶液称取15克化学纯酒石酸，溶于100毫升蒸馏水中。（2）2%氢氧化钠溶液称取2克分析纯氢氧化钠，溶于100毫升蒸馏中。（3）甲基橙指示剂溶解0.05克甲基橙于100毫升蒸馏水中。（4）试银灵指示剂溶解0.02克试银灵于100毫升分析纯丙铜中。（5）0.0192N氯化钠标准溶液取分析纯氯化钠于清洁的坩埚内。在电炉上加热，并不断用玻璃棒搅拌至爆裂声停止（使水分逸出）再将坩埚移入干燥器中冷却。称取氯化钠1.1220克，溶于蒸馏水中，将此溶液倾注入1升容量瓶中，并稀释至刻度。（6）0.0192N硝酸银标准溶液称取3.2617克分析纯硝酸银（先在105烘箱中烘半小时）溶解于蒸馏水中，稀释至1升，倾入棕色瓶中保存。使用时用氯化钠标准溶液标定。标定：用移液管精确吸取10.00毫升0.0192N的氯化