抗生素效价操作规程.doc

抗生素效价标准操作程序1、目的：建立一个抗生素效价的标准操作程序2、范围：抗生素效价的检测相关工作3、责任：生测组检验员4、内容：4.1 仪器用具与试药4.1.1 180干热灭菌2h：陶瓦盖 20个 ；试管(30200mm) 1支（依据菌液浓度方法而论）；镊子(23mm) 1把 ；100ml量筒 1个（依据菌液浓度方法而论）；25ml量筒 1个 ；锥形瓶 1个；钢管 80个；1ml吸管 2根；大口5ml吸管 2支；10ml移液管 2根 ；碟子 20个4.1.2 121高压湿热灭菌 20分钟：抗生素号培养基；工服 ；pH7.8磷酸缓冲液约；无菌水；烂烧杯3个（盛放有菌试管）；一次性塑胶手套。4.2操作步骤4.2.1对照品称量4.2.1.1从对照品管理人员处领取一支硫酸庆大霉素标准品（200mg），因标准品刚从冰箱取出，需放置室温平衡30分钟，然后拿到称量室，用已稳定(早点打开电源就能稳定)的万分之一天平称。4.2.1.2取一张滤纸（14）称出重量，然后清零，按“F”键把“g”转化为“mg”,小心加对照品，直至39.2mg，可以多称一点，也许会粘纸。把对照品轻轻倒入容量瓶，再复称一下称量纸，记录下来。4.2.1.3称取量加无菌水在容量瓶颈部口径处冲洗，观察到对照品溶解后加无菌水至刻度，充分摇匀，放置在冰箱。4.2.2 供试品称量4.2.2.1 准备一个干净50ml容量瓶，口径上附一个小漏斗（漏斗口径尽量挑选大一点的，可使供试品快速落到容量瓶）。把上述装备放到已稳定的万分之一天平称出数据，然后清零。从干燥器中取出供试品，倒入一部分到研钵中，顺时针快速研细颗粒，颗粒易吸潮，称取速度一定要快。4.2.2.2从万分之一天平中取出已清零的（容量瓶+漏斗），用药匙挑取供试品到漏斗中，再轻轻振动漏斗，使供试品落到容量瓶，加到一定量，拿容量瓶+漏斗+供试品到天平称重，如已接近12.5g，就打开天平上面的玻璃门，从上面慢慢加样，直到12.5g。4.2.2.3 称量完毕，用无菌水溶解。先用滴管（无菌水荡洗三次）把漏斗边缘冲洗干净，再冲容量瓶颈部边缘，轻轻摇动，让无菌水全部渗透颗粒细粉，然后超声处理15分钟，放置一段时间使温度降下，用无菌水加至刻度，充分摇匀，置冰箱4保存。4.2.2.4抗生素号培养基水浴加热溶解，大约耗时30，然后放到水浴锅中（温度不超过65，可设60），当培养基温度达到水浴温度后就可以倒底层。4.3 铺底层4.3.1倒底层时，用无菌白色手套拿25ml灭菌量筒，以免烫伤。量筒稍倾斜，盛培养基的锥形瓶靠着量筒慢慢“细线状”倒入不易引起气泡。拿开陶瓦盖，靠着平皿边缘慢慢倒入培养基，注意有无气泡，如有，可以慢慢移入平皿边缘，只要不影响抑菌圈。陶瓦盖不可马上盖上，以免温度太高水蒸气全部附于陶瓦盖，然后落入平皿中。4.3.2 消毒液0.1%新洁尔灭溶液擦拭桌面，拖地后，开启紫外灯30把通电开关（中效，过滤，风机）开关、（超净工作台）开关、（空气、温度、调节器）开关、（1,2,3号灯）开关、顶风柜开关，插座开关全部开关打开。铺完底层后，把通电开关和插座开关继续保留，其他一律关闭。4.4铺菌层4.4.1从冰箱取出供试品溶液，对照品及菌液放至室温，大约30分钟。4.4.2把空调打开，调温24。开关全部启动。4.4.3放置室温后，把菌液用烂烧杯盛放拿到操作间。用无菌1ml移液管吹打均匀菌液，然后按照预试好浓度吸取菌液至抗生素号培养基中，用5ml大口吸管吹打均匀，用嘴快速吸取至刻度，然后快速加入到铺了底层的平皿中。从正中间放下，再稍微拿起平皿转一圈，一定要铺平，要不抑菌圈会缺边或不圆。如果加了菌的培养基很容易凝固，那就准备一个内盛低于65水的陶瓷杯，把培养基放入杯中。4.4.4试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，保持菌种的新鲜，对易变的菌株在制备菌液前进行单菌落的分离，选择典型菌落以保持菌悬液中菌群的一致性，所得抑菌圈边缘清晰，整齐。4.4.5铺完菌层要立即盖上陶瓦盖，放置20分钟。4.6加钢管4.6.1放置10分钟时，可用灭菌镊子加钢管到钢管放置器中，平皿数4，尽量多放几个，放完拍打一下四根长管，怕有钢管卡住了。4.6.2 10分钟后，小心拿起陶瓦盖，再小心拿起平皿，一个一个拿到钢管放置器上，左手往下压一下左边一个开关，右手先向里推一下再向外推，钢管就落到平皿中。4.6.3 全部平皿中放置钢管就开始计时，十分钟。4.7 抗生素溶液的滴加4.7.1利用刚才铺完菌液和放置完钢管时间对供试品与标准品进行稀释。4.7.2用供试溶液荡洗两次5ml胖肚移液管，从50ml容量瓶中取供试品溶液上清液5ml至干净50ml容量瓶中。溶液吸至刻度后用滤纸擦拭一下底部再把溶液加到容量瓶。用缓冲液稀释至刻度，摇匀。4.7.3从摇匀的50ml容量瓶用5ml移液管吸取5ml溶液至另一个干净的容量瓶，即为供试品高浓度。吸取5ml溶液至100ml干净容量瓶即为供试品低浓度。两个容量瓶分别用缓冲液稀释至刻度，摇匀。挑选一根长滴管和段滴管用刚才两个溶液荡洗干净，然后分别放入100ml和50ml容量瓶中。4.7.4对照品溶液的配置同4.7.24.7.5十分钟后，把配置好的对照品溶液和供试品溶液拿到操作室，开始悬空滴加溶液至钢管，不能有气泡，不可接触到钢管，不可把溶液溅到平皿中。4.7.6每滴加完一个平皿立即盖上陶瓦盖。手在滴加其他平皿时，不可碰到已滴加溶液的平皿，要不作废。4.7.7全部滴完放置30分钟。4.7.8 30分钟后，把培养箱门，一更，二更，缓冲间，生侧室门全部打开，用垫了玻璃的板子小心放好平皿及陶瓦盖，然后小心移入培养箱。培养1416h,温度3035。效价检定操作注意要点4.8.1称量4.8.1.1标准品与供试品的称量均为一次取样称取，不得反复取样称取。标准品称量一般约为50毫克，特殊品种按标准品说明书。4.8.1.2吸湿性较强的样品，在称量前1-2小时，更换天平玻璃橱柜内干燥剂如矽胶。4.8.1.3注意要点：4.8.1.3.1称量样品的容器重量最大不超过10克4.8.1.3.2称量供试品与标准品应用同一天平及砝码4.8.1.3.3称量前，被称的样品应放在干燥器内至少30分钟，从冰箱取出的样品，需使其温度与室温平衡后，才可称量4.8.2稀释4.8.2.1粉末或结晶的供试品，第一步稀释应用容量瓶以消除体积上的误差，稀释至5001000单位/毫升的溶液，以后的逐步稀释，也尽量用容量瓶稀释，并不超过34步。4.8.2.2注意要点：4.8.2.2.1刻度玻璃吸管应从0刻度开始放溶液4.8.2.2.2吸管在量取溶液前，要用被量取的溶液润洗23次4.8.2.2.3稀释供试品与标准品用的缓冲液应用同一批和同一瓶内的缓冲液（同批的数瓶缓冲液合并后使用）4.8.2.2.4供试品与标准品所用的溶剂量及溶解时间等，应尽量一致4.8.2.2.5用于稀释的刻度吸管和容量瓶应经过标定4.8.2.2.6从冰箱取出的标准品溶液，必须先在室温放置使其温度达到室温后，方可量取4.8.3双碟的制备4.8.3.1倒底层（底层平板培养基的制备）4.8.3.1.1用水平仪检查效价测定操作台面是否水平，设法调整使达到水平或选用水平部分的桌面4.8.3.1.2培养基加热溶化后，在室温冷却至70左右，并仔细检查琼脂培养基是否溶化均匀，有无凝块4.8.3.1.3倒底层的双碟经热压灭菌后应置电热烘箱中微热，使其干燥后方可使用，避免双碟内有冷凝水4.8.3.1.4用灭菌吸管或其他灭菌分装器，吸取培养基20ml注入各个双碟内，平均摊布，用干燥陶瓦盖覆盖，待其凝固4.8.3.2倒菌层（菌层平板培养基的制备）4.8.3.2.1取出试验用菌液，如从冰箱取出，应预先在室温放置，使其温度与室温平衡后，方可使用4.8.3.2.2菌层培养基经水浴或蒸汽加热溶化后，应待其冷却到一定温度，才可加入试验菌液，对不同的试验菌掌握不同的温度菌层培养基的控制温度试验用菌液菌层培养基温度芽孢悬液大肠杆菌菌液金黄色葡萄球菌654848-504.8.4抑菌圈圆正的控制4.8.4.1抑菌圈边缘清晰度的控制4.8.4.2抗生素最后稀释液的浓度与抑菌圈直径的直线关系4.8.4.3标准品与供试品同质的要求4.8.4.4直线的斜率与截距4.8.4.5操作技术的注意要求4.8.4.5.1照抑菌圈大小预测试验，将菌液接种至菌层培养基内，菌液加入量（体积）以不超过培养基总体积的3%4.8.4.5.2庆大霉素检定菌层培养基加菌量%=（0.20.3）%4.8.4.5.3菌液制备:短小芽孢杆菌（63202），一个培养瓶芽孢培养物，加灭菌水10ml,洗下制成芽孢悬液，稀释1:3但是，由于培养基原材料可有差别，菌液浓度也有差别将菌液加入菌层培养基内后，立即充分摇匀，但应避免发生气泡。摇匀后，用灭菌吸管或其他灭菌分装器，吸取培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台用陶瓦盖盖上，使其凝固（必须摊布均匀，水平，此操作为效价检定的关键性步骤，对试验结果影响极大），约静置20分钟后，即可使用。4.8.4.6注意要点：4.8.4.6.1冬季室温较低时，倒好的底层双碟待凝固后，可先放入37孵箱内约3-4小时，使微温，使倒菌层时培养基易于摊布。预温并可驱除底层培养基表面的冷凝水，使菌层易于水平。4.8.4.6.2菌层培养基凝固后，即可放置钢管，从加菌层完毕到加钢管的时间，以不超过2030分钟4.8.4.6.3某些试验菌在倒菌层后，双碟加盖干燥的陶瓦圆盖后在室温放置30分钟，使琼脂表面干燥一些，可得较好的结果。在某些生长较快的试验菌倒菌层后，双碟加盖陶瓦圆盖后，在冰箱内稍放，使冷却，亦可得到较为满意的结果4.8.4.6.4放置钢管，最好用钢管放置器，如用镊子手工放置钢管时可用镊子尖端松开撑住钢管内壁，双碟放在钢管位置图上对好位置，然后将镊子收紧，钢管平稳落在培养基上。注意使各个钢管下落的高度基本一致。钢管放置妥当后，应试双碟静置10分钟，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。4.8.5滴加抗生素溶液及培养4.8.5.1滴加过程4.8.5.1.1滴加抗生素溶液用的玻璃滴管，顺用被滴加的溶液洗三次4.8.5.1.2每个