酶联免疫法定量检测克伦特罗.doc

RIDASCREEN Clenbuterol Fast酶联免疫法定量检测克伦特罗5上海必优生物科技有限公司 电话传真要RIDASCREEN Clenbuterol Fast（编号：R1701）竞争酶标免疫分析法定量检测尿液，血清/血浆，肝脏，肾脏，肉类和组织中的克伦特罗及其他-兴奋剂。试剂盒中包含有酶联免疫试验所需的所有试剂，包括标准溶液。试剂盒足够进行96次检测（包括标准）。定量检测需要微孔板酶标仪。样品处理： 尿液和血清/血浆：不需要样品处理肝脏，肾脏，肉类，组织：用RIDA C18 columns (Art. No. R2002)纯化试验时间： 样品制备（以10个样品为例）尿液（离心或过滤）.约10min肝脏，肾脏，肉类，组织.至少6h检测时间（孵育时间）.1h检测限：尿液，血清/血浆中的克伦特罗.100ppt肝脏，肾脏，肉类，组织的克伦特罗.100ppt回收率： 尿样. 90 % 12 %交叉反应： RIDASCREEN Clenbuterol试剂盒的特异性是通过测定相应物质的交叉反应而得到的。Clenbuterol .约100 %Brombuterol .约130 %Bromchlorbuterol . 约95 %Mabuterol .约86 %Clenproperol . 约25 %Terbutalin . 约10 %Salbutamol .约10 %Cimaterol .约6 %Carbuterol. 约4 %Isoproterenol. 0.1 %Adrenalin . 0.01 %Noradrenalin . 0.01 %1. 用途RIDASCREEN Clenbuterol竞争酶标免疫分析法定量检测尿液，血清/血浆，肝脏，肾脏，肉类和组织中的克伦特罗及其他-兴奋剂。2. 概要克伦特罗属于-兴奋剂，在畜牧业生产中常用于促进家畜的生产性能，特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例或加速动物生长。然而直到现在，这些化合物并没有被批准作为合法的加速生长调节剂。除了水解脂肪及合成代谢的作用外，克伦特罗还有对非条纹肌肉组织的松弛作用，当用作生长调节时，其剂量是治疗剂量的5-10倍，因此，克伦特罗非常有可能残留在动物体内，不合法的使用会给消费者带来危害。3. 测定原理测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对克伦特罗抗体的捕捉抗体。加入克伦特罗抗体后，会与捕获抗体连接。经过孵育及洗板步骤后，加入标准、样品溶液及克伦特罗酶标记物，样品中的克伦特罗与克伦特罗酶标记物竞争克伦特罗抗体（竞争酶标免疫分析法），没有连接的克伦特罗酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的克伦特罗浓度成反比。4. 提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个试验（包括标准测定），盒中的材料如下196孔板（12条8孔，可以拆分为单孔）包被有针对克伦特罗抗体的抗体。5克伦特罗标准溶液（1. 3ml/瓶）0 ppt （0标准）, 100 ppt, 300 ppt, 900 ppt, 2700 ppt克伦特罗水溶液，直接应用液1酶标记物（1.2ml）浓缩液红色帽1克伦特罗抗体（1.2ml）浓缩液.黑色帽1基质/发色剂（10ml）红色溶液.蓝色帽1反应终止液（14 ml）含有1N硫酸.黄色帽1缓冲液（25ml） 酶标记物和抗体稀释缓冲液5. 需要的材料但盒中不提供5.1设备 微孔板酶标仪（450nm） 搅拌器 振荡器 离心机和离心管（50ml） 刻度移液管 20l- 200l- 和200 -1000 l-微量加样器 RIDA C18 columns (Art. No.: R2002)5.2 试剂 甲醇 NaOH 正庚烷（或正己烷） 50 mM HCl 50 mM KH2PO4缓冲液，pH 3.0 500 mM KH2PO4缓冲液，pH 3.0 50 mM tris-HCl-缓冲液，pH 8.56. 操作者应该注意之事项反应终止液含有1N硫酸，避免接触皮肤。7. 储存条件保存试剂盒于2 - 8C (35 46F)，不要冷冻。将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封并保存在2 - 8C (35 46F)。红色的基质/发色剂对光敏感，因此要避光保存。不要使用超过有效期的试剂盒。不要交叉使用不同批号的试剂盒。8. 试剂变质的迹象若发色试剂出现任何其他的颜色，表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm0.6)时，表示试剂可能变质。9. 样品处理样品应当在阴凉处保存。这里提及到的所有样品处理方法适用于多种残留分析，不仅适用于克伦特罗，还适用于其他-兴奋剂。9.1 尿液和血清/血浆（不需要样品处理） 取20l样品（尿液，血清/血浆）直接进行检测（如果尿液混浊，建议试验前先进行离心或是过滤）。9.2 肉样9.2.1 低脂肪的肝脏，肾脏，肉类或组织 均质100-200g的样品，取出大部分进行试验 取5g样品到离心管中，加入25 ml 50 mM HCl，均质振荡20min 离心：15 min / 4000 g或更高的转速/10 - 15 C (50 - 59 F) 转移18ml上清液（相当于3g样品）到一个新的离心管中，加入2 ml 0.5 M NaOH混合约10min 加入10 ml 500 mM KH2PO4-缓冲液，pH 3，简单的混合并在4C(39 F)保存至少1. 5小时或过夜 离心：15 min / 4000 g或更高的转速/10 - 15 C (50 - 59 F) 移取10ml上清液（相当于1g样品），使其升至室温(20 - 25 C / 68 - 77 F)，用RIDA C18柱纯化（见RIDA C18柱纯化步骤）9.2.2 高脂肪的肉类和组织 均质100-200g的样品，取出大部分进行试验 取5g样品到离心管中，加入25 ml 50 mM tris-缓冲液，pH 8.5，振荡30min 加入15ml庚烷振荡5min以除去脂肪 离心：15 min / 4000 g或更高的转速/10 - 15 C (50 - 59 F) 用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层 再用15ml庚烷重复步骤3-5 向均质的肉液中加入0.5ml半浓(5-6 M)的盐酸，振荡1小时（或是振荡过夜） 称6g均质物（相当于1g样品）加入离心管中 离心：15 min / 4000 g或更高的转速10 - 15 C (50 - 59 F) 移取上清液到另一个离心管中，加入300 l 1 M NaOH混合15min 加入4ml 500 mM KH2PO4-缓冲液, pH 3, 简单的混合并在4C(39 F)保存至少1. 5小时或过夜 离心：15 min / 4000 g或更高的转速/10 - 15 C (50 - 59 F) 移取全部上清液（必须取干净），使其升至室温(20 - 25 C / 68 - 77 F)，用RIDA C18柱纯化（见RIDA C18柱纯化步骤）RIDA C18净化步骤(Art.No.: R 2002):所有试剂和样品提取液都应当回升至室温(20-25 C /68 -77 F)滴速：1滴/秒 用3ml甲醇（100%）洗涤柱子 用2ml 50mM KH2PO4缓冲液，pH 3.0洗涤柱子 样品进柱（见9.2.1或9.2.2） 用2ml 50mM KH2PO4缓冲液，pH 3.0洗涤柱子 用正压去除残留的流体并用空气或氮气吹2min干燥柱子 用1 ml甲醇（100%）洗脱样品，用一个新的小瓶（流速为15滴/分钟-用正压或是真空收集全部提取液） 在50 - 60 C (122 - 140 F)并且在弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂 用1ml蒸馏水溶解干燥的残留物，取20l进行分析注意：对于污染浓度较高的样品（大约3ng/g），如果需要进一步稀释，则用蒸馏水进行稀释。样品的储存方法 生肉样品应当冷冻保存 HCl-酸化后的样品在2 - 8 C (36 - 46 F)下最多可稳定3天 用KH2PO4-缓冲液提取后的样品（在用RIDA C18柱净化前），在2 - 8 C下最多可保存2天（适用之前要先离心） 用RIDA C18柱净化后的甲醇提取液在冷冻条件下可保存数周或是在2 - 8 C (36 - 46 F)下可保存2周 用蒸馏水溶解后的样品在2 - 8 C (36 - 46 F)下最多可保存1周另外，牛奶、饲料、眼和毛发的处理方法，如有需要可与当地的分销商联系。10. 检测步骤10.1 试验前准备1. 使用之前将所有试剂回升至室温(20 - 25C, 68 - 77F)。2. 克伦特罗酶标记物提供的克伦特罗酶标记物（盖红色帽的瓶）为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物。 在吸取浓缩液之前，要轻轻的振摇以便充分混均。用缓冲液以1: 11（1+10）的比例稀释酶标记物浓缩液 （200l浓缩液+2.0ml缓冲液，足够4个微孔板条用）。3. 克伦特罗抗体提供的克伦特罗抗体（盖有黑色帽的瓶）为浓缩液，由于稀释的抗体稳定性不好，所以只稀释实际需用量的抗体。 在吸取浓缩液之前， 要轻轻的振摇以便充分混均。用缓冲液以1: 11（1+10）的比例稀释抗体浓缩液（200l浓缩液+2.0ml缓冲液，足够4个微孔板条用）。10.2测定程序洗涤步骤要按照推荐的方法进行，操作过程中不要让板孔干燥。1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。2. 加入100l稀释后的抗体溶液到微孔底部，在室温(20 - 25 C / 68 - 77 F)下孵育15min3. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。用250l蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作两次以上。4.加入20l的标准或处理好的样品到各自的微孔中。标准和样品做两个平行实验。然后加入100ul 稀释后的酶标记物到微孔底部，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。室温(20 - 25 C / 68 - 77 F)下孵育30min。 5.倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体。用250l蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次以上。6.加入 100l基质/发色试剂到微孔中，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合并在室温(20 - 25 C / 68 - 77 F)下暗处孵育15min。7.加入100l反应停止液到微孔中。混合好在450nm处测量吸光度值以空气为空白，必须在加入停止液后30min内读取光度值。11. 结果可用专门的RIDASOFT Win (Art. No. Z9999)计算软件对RIDASCREEN ELISA试剂盒进行分析。标准曲线可以参考试剂盒中的质量报告。若不用计算软件，计算方法如下：标准的吸光度值（或样品）- x 100 = % 吸光度值0标准的吸光度值所获得的标准和样品吸光度值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。计算的标准值绘成为一个对应克伦特罗的浓度(ng/kg)的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度(ng/kg)可以从标准曲线上读出。1ng/kg的Clenbuterol相当于1ng/kg的Clenbuterol, 10ng/kg 的 salbutamol, 10ng/kg 的terbutalin, 0.7ng/kg 的brombuterol, 1.2 ng/kg mabuterol。为了获得样品中克伦特罗的实际浓度(ng/kg)，从标准曲