课题流程su.doc

课题计划 食品中防腐剂与甜味剂同时测定方法研究课题主要针对食品中几类常用防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸钾，甜味剂：糖精钠、安赛蜜进行高效液相色谱同时测定方法研究。1. 研究对象：果味饮料、含乳饮料、食醋、蜜饯2. 提取方法优选： 1）超声提取：超声功率、超声时间（10min、15min、25min）以果味饮料为研究对象，称取一定量的果味饮料于25mL的具塞比色管中，加入少量的水，置于超声清洗器里进行超声提取，在相同的超声功率下，分为三个超声提取时间10min、15min、25min。然后将不同时间超声提取的样品比色管中用水定容至刻度，充分摇匀后，于0.45m的膜过滤后，在相同的色谱条件下，测定防腐剂（苯甲酸、山梨酸）、甜味剂（安赛蜜、糖精钠）的含量，通过测定量的比较，从而确定最佳的超声提取时间2）高速逆流萃取（溶剂、时间）3. 不同蛋白沉淀剂筛选：通过查阅文献确定以下五种蛋白质沉淀体系，用于沉淀所测定样品中的蛋白质，从而除去测定样品中防腐剂（苯甲酸、山梨酸）、甜味剂（安赛蜜、糖精钠）过程中大分子对测定结果的影响。五种蛋白质沉淀体系：1）（106g/L）亚铁氰化钾(219g/L)乙酸锌2）(288g/l)硫酸锌(219g/L)亚铁氰化钾3) (200g/L)乙酸铅（30g/L）草酸钾(70g/L)磷酸氢二钾4) 乙醇5) 20硫酸铜5mol/L氢氧化钠以含乳饮料为研究对象，分别称取同一个含乳饮料，称取相同的量于10个25mL具塞比色管中,每两个为一组平行。第1、2管中分别加入2mL（106g/L）亚铁氰化钾溶液和2mL(219g/L)乙酸锌溶液，加入一定量的水;第3、4管中加入2mL(288g/L)硫酸锌溶液和2mL(219g/L)亚铁氰化钾溶液，加入一定量的水；第5、6管中加入2mL(200g/L)乙酸铅溶液和2mL（30g/L）草酸钾(70g/L)磷酸氢二钾溶液，加入一定量的水;第7、8管中加入一定量的无水乙醇，加入一定量的水；第9、10管中加入2mL20%的硫酸铜溶液和2mL5mol/L氢氧化钠溶液，加入一定量的水。 将10个比色管放入同一超声清洗器里，设置前面确定的最佳超声功率和提取时间，进行超声提取，超声完后用水将10各具塞比色管定容至刻度，充分摇匀后将比色管中的样品倒入50mL的离心管中在转速5000r/min的条件下离心10min中，离心后取上清液于0.45m的膜过滤后，在相同的色谱条件下，测定防腐剂（苯甲酸、山梨酸）、甜味剂（安赛蜜、糖精钠）的含量，通过测定量的比较，从而确定最佳的沉淀蛋白质效果，进而确定最佳的沉淀蛋白质体系。4. 色谱条件优化1）不同缓冲盐（乙酸盐、磷酸盐）比较在相同的pH条件（7左右），相同的流动相比例（甲醇与缓冲盐）条件，相同的柱温条件下，选择（0.02mol/L）乙酸盐和（0.02mol/L）磷酸盐不同的缓冲盐进行色谱分析。2）pH条件选择上述最佳的缓冲盐与甲醇作为流动相，选择相同的柱温和相同的流动相比例条件下，以处理样的pH作为研究对象，从而确定最佳的色谱分离样品的pH条件。3）流动相比例 选择上面确定的最佳缓冲盐、pH值，在相同的柱温条件下，分别取5%甲醇-95%缓冲盐、7%甲醇-93%缓冲盐、8%甲醇-92%缓冲盐、9%甲醇-91%缓冲盐、10%甲醇-90%缓冲盐为流动相，从而确定最佳的色谱条件 4）柱温 选择上面确定的最佳缓冲盐、pH值，最佳的流动相比例，以不同的柱温来进行色谱分离，从而确定最佳的色谱分离的柱温。1. 亚铁氰化钾溶液(106g/L)称量10.6g亚铁氰化钾于100mL容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解，水至刻度并摇匀。2. 乙酸锌溶液(219g/L)称量21.9g乙酸锌于100mL容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水至刻度并摇匀。3. 硫酸锌溶液(288g/L)称量28.8g硫酸锌于100mL容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水至刻度并摇匀。 4. 草酸钾一磷酸氢二钾溶液称取草酸钾3g、磷酸氢二钾7g溶于100mL水中5. 乙酸铅溶液(200g/L)称量20g乙酸铅于100mL容量瓶中，加适量水，震摇使之完全溶解加水至刻度，摇匀。方案一 亚铁氰化钾醋酸锌沉淀体系称量10g样品于50mL烧杯中，加入1.5mol/L12.550mL NaOH溶液，混匀后将烧杯放入超声波水浴15min。冷却后，用硫酸溶液调pH至8.0，加入1mL亚铁氰化钾溶液和1mL醋酸锌溶液，混匀，静置15min，加入20mL甲醇，混匀后冷却到室温，转移到50mL容量瓶中并定容到50mL，摇匀放置15min。方案二 亚铁氰化钾醋酸锌沉淀体系称量10g样品于50mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL醋酸锌溶液，加水至刻度，混匀后静置11.5小时。方案三 乙酸铅草酸钾一磷酸氢二钾沉淀体系称10g样品于50mL容量瓶中，加入8mL乙酸铅溶液和8mL草酸钾磷酸氢二钾溶液，加水至刻度，混匀后静至15min。方案四 亚铁氰化钾硫酸锌沉淀体系称量10g样品于50mL容量瓶中，加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL硫酸锌溶液，加水至刻度，混匀后静置一小时。方案五 乙酸铅草酸钾一磷酸氢二钾沉淀体系称10g样品50mL于容量瓶中，加入8mL乙酸铅溶液和8mL草酸钾磷酸氢二钾溶液，加甲醇定容至刻度，混匀后静至15min。除去蛋白的滤液用1+1氨水调pH值至7(方案一可以省去此步骤)，再次过滤后，经带0.45m滤膜的样品过滤器过滤后进样检测。盐析法可以使蛋白质沉淀。盐析法的原理 蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之