泥炭土还原菌的分离.doc

海南泥炭土硫酸盐还原菌的分离与鉴定前期分离：1. SRB分离培养基 : NaCL 15 g/L MgSO47H2O 6.8 g/L MgCL2H2O 5.7 g/L KBr 0.09 g/L KCL 0.7 g/L NH4CL 1 g/L KH2PO4 0.5 g/L CaCL2 0.075 g/L 酵母膏 0.1 g/L 乳酸纳 2 ML2. 分离方法： 称量1g土样，进行系列稀释，找合适的稀释度102，103，每个稀释度取200uL涂布SRB平板，厌氧条件下，37培养35天，观察，描述菌落形态并计数。然后挑取单菌落，接种到含Fe2+的液体培养基，验证分离的菌是否为硫酸盐还原菌。 同时分别取200uL涂布到含DBT的SOB平板和含Cr6+的SRB平板上，分离可以利用DBT和Cr6+ 的功能菌，培养3天，观察菌落形态，进行形态分类，然后挑取单菌落分别接种到含有DBT和Cr6+ 的液体培养基，37 ，100转，摇床培养，在培养到3天，6天时检测DBT和Cr6+ 的含量，计算细菌对二者的利用率。3.分离结果： （1）硫酸盐还原菌 挑取涂布平板上单菌落接种到液体检测培养基，未产生黑色沉淀，这类生长在培养基表层的厌氧菌，不能利用硫酸盐产生硫化氢，可能是还原力较低，有待于验证。 （2）利用DBT和Cr6+的功能菌 液体培养3天，一周，两周时，检测到二者的含量基本没有降低，从海南泥炭土中分离到这类功能菌能在含有DBT和Cr6+的培养基上生长，只是利用率很低。07年10月15日后的分离工作SRB分离培养基（更改后配方） MgSO47H2O 2.0g/L NH4CL 1 g/L KH2PO4 0.5 g/L CaCL2 0.1 g/L 酵母膏 1 g/L 乳酸纳 2 ML/L Fe(NH)2(SO4) 6H2O 1.66g/L 改进的分离方法： 称量1g土样，10倍稀释，取稀释液0.5mL接种到液体培养基，37 培养，观察是否有黑色沉淀产生，若有则证明土样中存在SRB,然后进行系列稀释倒板，厌氧条件培养。从平板上挑取单个黑点，接种到液体培养基，镜检，观察是菌否纯。结果： （1） 还原菌分布 0cm-100cm共10层土样中，均检测到硫酸盐还原菌;100-150cm土样中未检测到还原菌。倒平板分离的还原菌的还原能力比早期涂布平板分离到得细菌还原能力强。上6层土样，镜检观察至少每层黑色沉淀中有两种均存在，目前还未将这菌纯化出来。 （2）镜检结果 （3）种类分布 由镜检结果可以看出不同土层还原菌的种类不同，有待于分离出单菌落后确定每个土层硫酸盐还原菌种类的分布。表一。 （4）鉴定 液体培养镜检后较纯的菌，作DSR（特异性编码亚硫酸盐还原酶的基因），从分子上确定分离的菌是否为硫酸盐还原菌。目前已经提取出DNA，然后dsr引物进行PCR，验证是否为还原菌。由镜检结果表明，挑取小黑点，接种到液体培养的菌基本不纯。表1 土样中还原菌种类土样深度SRB种类形态菌形态相似性5-10cm2短杆菌和长杆都含一类长杆菌20-30cm2短杆菌和长杆30-40cm2短杆菌和长杆60-80cm2短杆菌和长杆第2层土样（5-10cm）5层土样（20-30cm）6层土样（30-40cm）8层土样（60-80cm）实验安排： 1. 用dsr 确定分离的菌是