RNA探针杂交步骤以及效价测定.doc

RNA探针杂交步骤以及效价测定RNA探针是一段单链cDNA分子，本文总结了RNA探针的分类、制备方法、探针的纯化、杂交前的注意事项，RAN探针效价的测定以及探针的选择。RNA原位杂交中的探针(一)探针的种类RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。1. 单链cDNA探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。2. cRNA探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响。因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。由于cRNA探针具有以上这些优点，cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，因此在原位杂交中应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏，易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。3. 寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括3H、35C、32P和125I等，不同的同位素探针其穿透力、定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短、性能不稳定、污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干扰等缺点，其应用越来越广泛。(二)探针的标记在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。1. 酶反应法：用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。2. 体外转录法：体外转录法是一种制备与片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时，先将靶核苷酸序列转入到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多位点的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖苷核，所有的RNA就被标记。依标记物为同位素和非同位素，近年来非同位素标记探针已有了极大的进步。常用非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素抑制，只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展，先将标记物结合在探针上，通过特异性识别，由特异性结合多种酶，对检测的杂交信号作用放大，这一类标记法已展示极好的发展前景。(三)探针的纯化某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解1015% 的水，从而溶解一部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。(四)杂交前准备1. 载玻片和盖玻片的处理为有效防止外源性RNA酶的污染，杂交用的载玻片和盖玻片可按以下步骤处理。将载玻片和盖玻片分别浸泡在5% 洁消精中12小时，用3540 温水中冲洗30min，再用双蒸水漂洗3次，每次5min，室温下干燥切片后，在180 烤箱内烘烤46小时，盖玻片可按近期内所需量，用铝箔纸包裹后烘烤后存放。为防止组织或细胞标本在杂交过程中漂起或脱落，载玻片应涂以粘附剂，大的冰冻或石蜡切片建议用明胶粘附剂，活检或较小的标本建议用多聚左旋赖氨酸或硅烷粘附剂。2. 明胶涂片制备取10克明胶溶于1000毫升4050 双蒸水中，待明胶完全溶解后加入4毫升25% 硫酸铬钾溶液(chromium potassium sulfate CPS) ，使CPS的终浓度为0.1%。将烘烤后的载玻片浸泡在明胶溶液中10min，在室温下干燥玻片。再将载玻片浸泡在含有1% 多聚甲醛，pH7.4的PBS溶液中10min;在室温下干燥玻片后再将载玻片浸泡在含有1% 多聚甲醛，pH7.4的PBS中10min，在室温下干燥玻片。60 烤箱内过夜备用。3. 多聚左旋赖氨酸涂片的制备取24mg多聚左旋赖氨酸，分子量在300000以上，溶于1ml消毒去离子水中。经旋涡器反复搅拌，吸取2030l滴加到玻片一侧，再取另一张载玻片复合，将赖氨酸溶液均匀涂抹在裱组织切片处，并将涂有粘附剂的一面用铅笔标出，室温下干燥切片后，在60烤箱内过夜备用。4. 硅烷涂片的制备取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane APES)溶于250ml丙酮内。将烘烤后的载玻片浸泡硅烷溶液中60min，用双蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60 烤箱内过夜备用。注意事项：载玻片的粘附剂及涂片制备，以组织切片或细胞不脱落、不干扰杂交信号、低背景、经济及制备方便为原则，在制备过程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮肤上的RNA酶的污染。多聚左旋赖氨酸溶液的浓度可按实际应用效果调整，并应注意有效期限，制备载玻片应尽快使用，防止赖氨酸解聚而失效。5. 新鲜标本的储存和冰冻切片制备为RNA原位杂交作新鲜标本储存和冰冻切片过程中，应严防RNA酶的污染，制备过程中所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1% 焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate DEPC)水清洗。为防止RNA迅速降解，标本离体后，先切成1.51.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4% 多聚甲醛溶液内，置4冰箱内24小时。再将组织移入30% 蔗糖PBS溶液内，4 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80 或-140 超低温冰箱内保存。如作冰冻切片，先将组织在-20恒冷切片机内停留，待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7m薄片。40 烤箱内干燥切片2小时后储存在-80 或-140 超低温冰箱内备用。6.标本的固定和石蜡切片的制备石蜡切片作RNA原位杂交的，也应严防RNA酶的污染，容器、刀具等去除RNA酶的过程同冰冻切片。为防止RNA迅速降解，离体后标本应立即有效固定。为保存良好组织结构，有利探针的穿透力，应选用合适的固定剂。常用的化学固定剂可分为沉淀固定剂和交联固定剂两类。前者有乙醇、甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛、甲醛和戊二醛等。经沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入，但过长时间固定可引起RNA降解。其不足之处是：组织形态结构的保持不如交联固定剂。交联固定剂能较好保存组织中RNA和组织形态结构，但固定时间过长，也可发生胞浆和胞核内大分子化合物形成交联，影响探针的穿透力，阻碍杂交体的形成。4%多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分别溶于100ml 0.01mol/L pH7.0 PBS溶液，组织在常温下浸泡于4% 多聚甲醛中4小时，每1小时将组织在真空下吸干10min，再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/L pH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。福尔马林醋酸固定液福尔马林醋酸固定液由50% 酒精、10% 福尔马林和5% 醋酸组成。在常温下将组织浸泡4小时，每1小时在真空下吸干10分钟，再注入新的固定液，共4次，然后用50% 酒精漂洗2次，每次30min。(五)杂交前探针的选择1. RNA探针：RNA探针的长度以50150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。(1)孵育时间t=Lf- Lo/ K LoLf (Lo=核酸探针原长度(kb)，Lf=核酸探针水解后所需长度(kb)，K是常数率=0.11kb/min)。(2)在室温中加入下列终止水解：3mol/L醋酸钠，6.6l(终浓度0.1mol/L)，醋酸1.3l(终浓度为0.5%)。(3)加入下列沉淀探针：7mol/L醋酸铵100l，100%乙醇750l，RNA (10mg /ml) 2l，置-20 2 小时后恢复到室温，在1400rpm离心30min。(4)小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10ng/l浓度。(5)最终探针长度可于10% 聚丙稀酰胺凝胶在60 的尿素中电泳检测。2. 探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/l，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/l。杂交液的量要适当，每张切片以3050l为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3.杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30。多数RNA原位杂交Tm为95，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1% 甲酰胺浓度可降低0.72。另外杂交体中GC的百分比、杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰RNA探针的制备样本DNA的性质1、 纯度：高纯度质粒提取试剂盒提取并纯化2、 大小：100bp-10kb，大于10kb需要限制性内切酶的酶切3、 含量：1ug质粒DNA10ug标记RNA样品制备1、 在克隆插入位点下游，使用限制性内切酶将质粒线性化2、 为了避免不需要序列的转录，使用限制性内切酶对5段进行修饰3、 酶切后，使用高纯化的PCR产物纯化试剂盒纯化或工作液的准备溶液 准备 储存 用途水：PCR级或 双蒸水中加入0.1% 15-25 调整溶液体积或DMPC处理水 methylpyrocarbonate resuspend RNAEDTA 0.2M ethylene-diamino- 15-25 终止反应Tetraacetic acid, pH 8.0步骤标准RNA标记反应1、1ug纯化的模版DNA或4ul对照DNA进行消毒，加足够的水至13ul体系2、将反应物均放在冰上，然后加入下列试剂：10 NTP labeling mixture 2ul10 Transcription buffer 2ulProtector RNase inhibitor 1ulRNA Polymerase SP6 or 2ulRNA Polymerase T7轻轻混匀并瞬时离心，37孵育2h。(长时间的孵育并不能增加标记RNA)3、加2ul DNase I，除去模版DNA;37孵育15min(试剂盒可不做此步骤)4、加2ul 0.2M EDTA(pH8.0)终止反应。探针的储存:-15至-25下保存1年，避免反复冻融标记效率的测定RNA Dilution Buffer：DMPC处理的ddH2O:20SSC：formaldehyd=5：3：2，新鲜配制rna探针怎么检测效率问题：1.我用DIG法检测DNA含量，可是在探针标记效率检测时，按试剂合说明书稀释1ng/ul 10pg/ul 3pg/ul 1pg/ul 0.3pg/ul 0.1pg/ul 0.03pg/ul 0.01pg/ul，4号标准探针(Lebeled Control DNA )只到0.03pg/ul的点显色，而且我做的标记效率很低。请教各位，怎样加深Lebeled Control DNA 显色效果和提高探针标记效率?这个检测步骤比较多，中间过程复杂，所以只是单纯讨论你的结果比较难，要从各个步骤去优化。如果kit里面带的control DNA都达不到应有的灵敏度，可能是操作过程有问题，因为DNA是标记好的，只剩下与抗体反应和显色两个步骤了，可以从这两步找找原因。至于你的样品，可以先用直接检测法验证标记的效率，如果达不到要求，可以先想办法改进标记过程，比如DNA过大的话应该用适宜的内切酶切成小片段，延长标记时间等等，一般标记是不大容易出问题的。主要还是杂交这一步要注意，要摸索适宜的杂交温度，模板纯度不高也会影响杂交效率。一般的DIG检测的kit都是随机引物扩增法标记, 一般都能达到浓度标记的要求.如果确实标记的效率上不去, 推荐使用PCR直接扩