BrdU掺入实验.doc

1、 BrdU掺入实验：注释：溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有1.1%。既往在分子遗传学等研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速，然而其敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术不断改良提高，应用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷相似。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性标记物之一。本文综述近年来BrdU研究概况，重点介绍标记过程中有关技术问题。一、标记技术：1、剂量和途径：BrdU可用于体内或体外标记，体内标记时，实验鼠按体重60mg-200mg/kg于鼠腹膜射，狗按体重100mg/kg静脉注射，人体以表面积150g/m2用量，取标本前8.25-10h静脉注射，免疫组化检测。BrdU经静脉给药一般无副作用，偶有道过量可致细胞突变。体外标记的研究广泛而深入，通常将保存在培养液中的新鲜组织剪啐至1-2mm3大小，离心去除了上清液后，加入100g/mlBrdU，或新鲜组织在0.3mg/ml浓度的BrdU中37摄氏度1小时，然后固定包埋，细胞标记在RPMI1640-10培养液中进行，细胞数低于1106/ml，加入20l的BrdU孵育202、标本处理：适当的标本处理对BrdU染色强度至关重要。Meyer对450例乳腺癌组织体外标记总结出3点经验：切组织块1mm厚；固定前组织有代谢活力；封闭脱氧胸腺核苷合成酶，因此酶能使脱氧尿苷转变成脱氧胸苷，从而阻止内源性脱氧胸苷与BrdU竞争掺入DNA。Xiang最近回顾大量文献。广泛讨论固定包埋方法后，制备狗胫骨骨折模型，设3组对照研究，结果证实70%乙醇固定，epon包埋未脱钙狗骨组织的BrdU染色效果最好。Swales和Smith用BrdU单抗在超微水平研究昆虫血脑屏障，重点探讨标记过程对细胞超微结构特征的影响。比较4种固定后得出如下结论：单用多聚甲醛固定可获得良好的标记效果，但细胞结构易损伤，可加入单节显性戊二醛联合固定；等渗缓冲液加蔗糖磷酸/盐酸缓血酸胺缓冲剂或PBS对保持细胞结构有较好效果；用脱氧胆酸处理可增加标记，促进抗体联接，该项研究清楚显示线粒体，高尔基体、内质网等结果器。也有人建议如预备蛋白酶消化时，可用甲醛固定，而不用Carnoy或乙醇。3、DNA变性BrdU掺入单链DNA碱基序列须经酸、碱、酶或加热等打开DNA双螺旋结构中的氢键，离子键和碱基推积力使DNA双链分离单链。DNA变性方式及程度直接影响标记效果，Williamson等回顾123份关于结直肠癌的告，发现用酸变性约占80%，在0.05-3.00MHCL间设9个浓度比较分析，对每种浓度作用的组织切片分别数5103个细胞，结果冰冻切片0.01MhCL浓度变性后标记指数最高。低浓度酸产生高LI的原因可能DNA双链失稳态，组胺蛋白离解产生易使抗原掺入的SSSN段，另有人提出用低浓度酸从DNA离解出组胺蛋白后加热变性，可避免组胺产生稳定DNA低抗热变性的作用。消除组胺可降低原位DNA的熔解温度阈，酸预处理使染色质核小体结构几乎全部破坏，从而使DNA解螺旋更广泛。坚持热变性者认为加热较酸对BrdU掺入能提供更多结合部位。此外，变性和单抗孵育须严格衔接，如变性后BU20a单抗孵育延误1小时，BrdU阳性细胞核标记数便从6.6%降至1.4%，说明影响LI的因素复杂，加单抗前仔细研究变性技术及干扰因素，从而获得BrdU标记应有的高LI是必要的。另外采作BrdU标记核酸分子可能对DNA变性有非凡要求，需进一步探索。4、标记染色：如何延长BrdU作用时间以标记新进入S期的细胞。使增殖缓慢的细胞标记率提高，是另一个重要问题，早年有人用恒定套管装置和非生物降解弹丸对大鼠研究，但结果重复性差。近来Maysinger研制一种具有很好的生物相容性可降解的微囊用于体内、外标记，通过电镜、影像技术及免疫细胞化学分析，证实微囊中BrdU能有效掺入鼠脑疾患四周的增生细胞核中，可连续释放高浓度BrdU达48-50小时。另有人研究渗透性微囊和缓弹丸，发现标记效果均优于单次注射。研究非放射性标记物常与放射性标记物相比，以证实特异性，敏感性及其它有关特性，在同一靶细胞比较似乎更具有说服力。然而3H-TdR和BrdU的比标记研究不能在同一时间给药，因两种标记物在同一个细胞增殖周期内竞争胸腺嘧啶激酶。有人认为两种标记先后给药均可，另有主张先标BrdU，理由是3H-TdR放射自显影乳胶用胰酶去除时偶有细胞丢失，致其后BrdU标记信号损失，Lin等强调BrdU标记时间较3H-TdR长约50分钟，如先标记3H-TdR可望BrdU能标记更多早期S期细胞。Thoolen从另外角度观察两种标记染色之间关系，将成年的雄鼠分3组，腹膜下分别注射3H-TdR，BrdU和两中标记物曲小时后取睾丸标记处理，免疫金银法染色，分别计数精原细胞每组平均阳性胞核数量，结果3H-TdR标记为162个，BrdU标记为166个，双标记为146个说明90%BrdU掺入的清原细胞显示3HTdR标记，另有10%胞核仅显示一种标记，无交叉性。3H-TdR的射线散射范围有限，使放射自显影反应不可能超过远离乳胶1m以上的胞核，这些胞核或许能被BrdU标记显色，少数细胞仅接受一种标记的确切原因不清楚，也可能与碱基配对所形成的氢键数量有关。此外已证实微波，氯化锂13】、氟尿嘧啶核苷等均有助于BrdU标记。二、检测：BrdU特异掺入S期细胞，通常测定其LI，即S期细胞占细胞周期的百分数，标记阳性为光镜下致密覆盖于胞核上的褐色沉淀物。检测方法用单抗或多抗的免疫化学法，也可用DNA荧光染料染色的细胞化学法。目前常用免疫金银法，因该法不受内源性过氧化酶影响，较免疫酶标法有更好对照背景。不同类型细胞DNA对变性敏感性的差别可能由染色质结构决定，某些类型对变性反应迟钝，使检测不敏感或失败，有人提倡单抗联接BrdU后用FCM检测较免疫组化法更客观省时，且可测出肿瘤倍体。但需注重恶性瘤常伴组织及细胞坏死，BrdU不能掺入死亡细胞，故用FCM分析须除外死亡细胞，否则可被错误当成静止细胞。胰酶和Dnase混合孵育细胞标本有可能克服死亡细胞干扰三、BrdU标记和3H-TdR标记的比较与32P、35S等常用放射性核素相比，3H-TdR释放的-粒子能量低，散射极少，因此感光乳胶上的成影分辨最高，放射性损伤相对较小，且半衰期较长。3H-TdR标记用放射自显影术和闪烁计数检 测，灵敏度高，结果确切。其应用价值已经肯定。因此研究非放射性标记物多以3H-TdR为标准对照。在肿瘤生物学和细胞增殖动力学的研究中，Mayer在试管内分析一组人乳腺癌大样本，比较BrdU和3H-TdR的标记效果，3H-TdR标记234例，平均LI为6.90.4%；BrdU标记450例，平均LI6.40.3%，两种标记物无显著差异。BrdU和3H-TdR标记的肿瘤大小，组织类型，淋巴结转移，胞核大小以及DNA倍体均正相关，充分说明两种标记物之间的密切关系。在同一靶细胞标记也证实90%以上标记3H-TdR阳性细胞也标记有BrdU，反之亦然。四、应用：BrdU标记用于DNA修复、复制、分子杂交的重组DNA技术可替代同位素标记，在分子生物学、遗传学、细胞增殖动力学，肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力等领域有广泛应用价值。Kitazaws等用BrdU标记对白血病细胞HL-60和K562基因表达进行研究，将标记DNA和RNA原位杂交，发现80%用于合成DNA的胸腺嘧啶被BrdU替代。Stevenson等用BrdU单抗和FCM对哺乳动物细胞BALb/C，3T3，Colon26等6种细胞系研究杀瘤性巨噬细胞的细胞毒作用对细胞动力学的影响。受试细胞系接触M之前，先经BrdU脉冲标记，即在适当时间加入BrdU，只作用短时间马上洗去，以保证BrdU掺入DNA的精确时间，结果发现在12小时的细胞培养中，6促细胞系的细胞均可被杀瘤性M阻滞在细胞周期的每一个时相内。近几年来，由于BrdU标记方法敏感、简单和迅速，该技术在肿瘤增殖动力学领域的研究也非常活跃。目前BrdU标记不仅用于肿瘤诊断，评估预后，对指导肿瘤治疗已受重视，将活检标本LI作为 术后的是否行辅助治疗的依据，尤其对增大的区域淋巴结价值更大，区域淋巴结已转移病例可按LI高低确定化疗方案，现已明确小剂量化疗后肿瘤复发者是LI高的病例，而不是LI低者。值得提出的是BrdU的LI较FCM的DI更客观可靠，因FCM难于识别双相二倍体和异倍体肿瘤DNA分布的S期细胞，而且DI的S期细胞数也可能含有死亡细胞。此外已证实BrdU替代腺嘧啶所合成的DNA对放射性物质更敏感，使肿瘤对放疗的敏感性增加。可以预言，BrdU标记作为一种新近倍受重视的材料和方法在生物医学领域的应用前景将会十分广阔。BrdU掺入试验详细步骤：第1天1. 用100M的BrdU工作液（用5mg/ml的储存液以6L/mL稀释而成）标记细胞。胚胎干细胞，30分钟3T3细胞，2.5小时二倍体成纤维细胞，46小时2. 胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400g或1700rpm离心5分钟，去上清，加入10 mL 70% EtOH重悬。3. 保存在20过夜或数天。第2天1. 将第一天的标本离心去上清，并用洗涤缓冲液（PBS + 0.5% IFS）洗涤。2. 离心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5% IFS （必须新鲜配制！），室温孵育20分钟。3. 加入1ml洗涤缓冲液洗涤细胞。4. 离心去上清，以0.1M的四硼酸钠（Na2B4O7）重悬细胞，室温孵育2分钟。5. 用1ml洗涤缓冲液洗涤细胞2次（分出一部分细胞用于PI单染，见第10步）6. 用50L洗涤缓冲液重悬细胞，加入anti-BrdU抗体，4孵育20分钟。7. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗一次。8. 用50L洗涤缓冲液重悬细胞，加入用于封闭Fc段的抗体（如FITC-conjugated rabbit anti-mouse (F(ab)2 fragments等），4孵育20分钟。9. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗涤一次。10. 以0.3ml PI（10g/ml）重悬细胞，室温孵育30分钟。11. 准备上机。（配置试剂： BrdU溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下称取BrdU 2mg，然后在无菌室内加入无菌生理盐水4ml，用黑纸避光，4冰箱保存，新鲜配置。）Brdu掺入实验12 分别接种肿瘤细胞和正常细胞于置有盖玻片的6孔板内, 5105/孔, 培养过夜, 用40 mol/L TCLA处理细胞, 对照组不处理. 36 h后加入20 g/L Brdu, 继续培养12 h, 固定(甲醇丙酮 = 11)细胞贴片, 按照S-P试剂盒(SP9001)操作. 显微镜下计数3个视野下的阳性和阴性细胞数. 计算阳性细胞百分率即阳性细胞百分率 = 阳性细胞数/(阳性细胞+阴性细胞数)100%.我觉得 EDU 和 MTT 都要简单些、速度还快，推荐MTT:（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；