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CRISPR cas9基因编辑技术及应用 一种来源于细菌获得性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶向基因获得性修饰的技术 1 1 CRISPR Cas系统简介 1987年 日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列 随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中 2002年 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 CRISPR 2005年发现CRISPR的间隔序列 spacer 与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源 推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵 2013年初 MIT的研究组首次利用CRISPR Cas9系统对人293T细胞EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞Th基因实现了定点突变 2 1 2 CRISPR Cas9作用机理 CRISPR Cas系统的结构 CRISPR CAS系统的组成主要包括 由不连续的重复序列R repeat 与长度相似的间区序列S spacers 间隔排列而成的CRISPR簇 前导序列L leader 以及一系列CRISPR相关蛋白基因cas Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶 能在guideRNA引导下对靶位点进行切割 它与folk酶功能类似 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用 3 CRISPR cas9作用机理 1 CRISPR的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM NGG序列 将临近PAM的序列作为候选protospacer 然后在CRISPR基因座的5 端合成重复序列 最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 2 CRIPSR基因座的表达 包括转录和转录后的成熟加工 3 CRISPR Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 4 2 CRISPR cas9技术的应用 CRISPR Cas9介导的基因组精确编辑技术 CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术 通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造 将其连接在一起得到sgRNA singleguideRNA 融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力 但因为结构得到了简化更方便研究者使用 通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接 得到可以同时表达两者的质粒 将其转染细胞 便能够对目的基因进行操作 Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程 Cas9质粒建立knock out细胞系 1 设计识别靶位点的一对DNAOligos选择PAM NGG 5 端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列 即敲除的靶位点 确定待敲除位点后 选择23 至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中 然后进行设计运算 软件会自动输出sgRNA序列 利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列 2 构建可表达sgRNA的质粒3 sgRNA活性检测4 利用Cas9质粒建立knock out细胞系 5 CRISPR Cas9技术基因敲除实例流程 6 CRISPR 技术的前景及优缺点 1CRISPR Cas9技术的优势而且从实际应用的角度来说 CRISPRs比TALENs更容易操作 因为每一对TALENs都需要重新合成 而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰 Cas蛋白不具特异性 编码sgRNA的序列不超过100bp 因此比构TALENs和ZFNs更简单方便 较短的sgRNA序列也避免了超长 高度重复TALENs编码载体带来的并发症 2 CRISPR Cas9技术的缺点 1 脱靶效应 7 CRISPR 技术的前景及优缺点 3 2CRISPR Cas9系统的应用前景1 在基因敲除方面具有绝