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第三章细胞生物学研究方法METHODS AND TECHNIQUES第二版和第三版P49从整个生命科学的发展趋势看细胞生物学研究分子水平 细胞水平结构功能 细胞生命活动分析 综合整个生命科学的发展最终是要解释生命的活动规律，而生命的活动规律要到细胞中去寻找。而要了解细胞的活动规律，我们要在分子水平细胞内各种生物分子的代谢规律，这就需要研究细胞内的各种组分另外我们还要了解细胞的结构和功能，2由于课时所限，我们不可能所有的方法都详细讲解。3Main point第一节 显微技术(细胞的形态学观察技术） 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术第二节 细胞分离技术第三节 生物化学与分子生物学技术第四节 细胞培养与细胞杂交本章重点：1. 掌握细胞形态结构的观察方法（主要是光学显微镜、电子显微镜）；2. 掌握细胞培养、细胞工程的基本技术；3. 了解细胞组分的分析方法。第一节 显微技术工具是人类器官的延伸。显微镜300多年的改进是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。 在器具上，包括选择投射于物体上的波束的性质及为便于观察而不断改善操纵装置； 在观察对象上，则是如何突显待观察的部分。 波束有光波和电磁波， 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。第一节 显微技术、光学显微镜(The Light Microscopy)（一）普通光学显微镜骆驼刺根尖染色体对二氯苯饱和溶液处理 9光学显微镜是如何作到这一点的?（一）普通光学显微镜可变光阑 管镜 目镜 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。放大率（magnification）:最终成像的大小与原物体大小的比值;分辨率/力（Resolution）：分辨或区分两质点间最小距离。 （一）普通光学显微镜3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。D=0.61/Nsin其中为入射光线波长；N=介质折射率； Nsin 镜口率 (低倍镜0.28，高倍 镜0.65，油镜1.25.2 =镜口角(样品对物镜镜口的张角);通常2最大值可达140度，空气N1，D约0.3um。油镜N1.5，此时分辨率D可达0.2um，思考：如何提高显微镜的分辨能力？12表一、几种介质的折射率（二）相差显微镜Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. A+/B+相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种：1.A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。2.B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。（二）相差显微镜基本原理： 利用光的衍射和干涉现象，把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高各种结构间的对比度，明者更明，暗者更暗，立体感增强，使各种结构变得清晰可见。故样品不需染色，适合观察活细胞。 （二）相差显微镜与普通光学显微镜相比有两个特殊之处： 相位板环形光阑（位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 使用时，环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上 18环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。 用途：可观察未经染色的玻片标本，活细胞动态，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 （三）微分干涉差显微镜 （DIC）原理：利用两组平面偏振光的干涉。光线经棱镜折射后分成两束，分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。20平面偏振光 光是一种电磁波,光振动的方向与它前进的方向垂直。 基础知识样品经过微分干涉差显微镜 ,厚度上的微小差异就转化成明暗区别，增加反差，加强影像的明暗效果。 标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。用途：微分干涉差显微镜用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。DIC显微镜下的硅藻(伪彩色) (A)普通明视场显微镜下的纤维原细胞(B)相差显微镜下的纤维原细胞, (C)微分干涉显微镜下的纤维原细胞(D)普通暗视场显微镜下的纤维原细胞. 23微分干涉差显微镜 原生动物阿米巴变形虫的显微照片。进行人工上色的三维图像展示了丰富的细节。 细胞中有些物质，如叶绿体等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料（酸性品红、啶橙，中性红、甲基绿）或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜不仅对这类物质可进行定性、定量和定位研究，还可观察其形状及在细胞内的变化。（四）荧光显微镜 Fluorescence microscopeFluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green微管呈绿色、微丝红色、核蓝色还可进行免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。图像清晰，色彩逼真。（四）荧光显微镜 Fluorescence microscope特点：1.光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；2.有两个特殊的滤光片；3.照明方式通常为落射式。27荧光显微镜是在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。 免疫荧光技术 荧光素直接标记技术 GFP基因与某种蛋白基因融合，可直接观察该蛋白的动态变化。28第一套滤光片为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有能激发荧光染料发光的特定波长才能通过。第二套为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让染料所发出的荧光通过。这样，在黑暗背景衬托下，很容易观测到发出荧光的样品。beam-splitting mirror（半透射反射镜）：倾斜的、透明的镜子，使光垂直地反射到观察者的眼中 。Figure 3-8. Fluorescent dyes. The structures of fluorescein and tetramethylrhodamine, two dyes that are commonly used for fluorescence microscopy. Fluorescein emits green light, whereas the rhodamine dye emits red light. 荧光素罗丹明（五）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM原理： 一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些分层图像再由计算机重构成三维图像。LCSM的原理：物镜成像透镜共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。 样品制备无特殊要求；各种染色、非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。激光共聚焦扫描显微境特点与用途：特点：用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途：亚细胞定位及动态变化。能扫描不同层次，重构出样品的三维结构（立体图像）。可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。爪蟾 黑色素细胞LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管共聚焦显微镜由于可以自动改变观察的焦平面，因此纵向分辨率得到改善。分辨率越高，意味着可使用的点数越多，图像越细致。 受精5天后的卵子 ，一些精细胞仍粘贴在它表面。胚胎和精细胞核呈紫色，而精子的尾巴是绿色。蓝色区域是缝隙连接，它们把细胞彼此联系在一起。 果蝇原肠胚表层细胞质内免疫荧光标记的微丝A.免疫荧光技术 B.LCSM36GFP标记的鼠神经中枢干细胞移入刚出生的小老鼠的脑内，已经开始形成少突细胞和星细胞。” Figure 3-3. Edge effects. The interference effects observed at high magnification when light passes the edges of a solid object placed between the light source and the observer. （六）暗视野显微镜 dark field microscope38光学上的丁达尔现象 （六）暗视野显微镜 dark field microscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。应用：观察未经染色4200nm的活体或胶体粒子。（核、线粒体），分辨率比普通显微镜高50倍。(a)梅毒螺旋体，暗视野。(b)团藻属和水棉属的绿藻；暗视野。 (c)迂回螺菌具有束状鞭毛的一种个体很大的细菌。相差。(d)肉毒梭菌，它具有近端生卵形内生孢子；相差。(e)草履虫染色后观察到的中央大核和在其边上的球形小核；相差。 abcde（七）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下，照明系统在载物台之上，用于观察培养的活细胞荧光共振能量转移技术用于研究生物大分子之间的距离和相互作用。 传统的蛋白质-蛋白质间相互作用的研究方法都要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究 。 荧光共振能量转移技术技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。 （八）荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 43（八）荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 以GFP的两个突变体CFP、YFP为例简要说明其原理： CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时(10nm范围内)，用CFP的吸光激发，其发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。荧光共振能量转移技术就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近（5um;Sections of TEM: 2.5万rpm，离心力8.9万，称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达10 0000r/min，离心力超过50 0000g。（一）差速离心 Differential centrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核叶绿体线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 Figure 3-36. Comparison of methods of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation. （二）密度梯度离心A. 速度沉降 velocity sedimentationB.等密度沉降 isopycnic sedimentation用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于 被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数 以不同的速度沉降而达到分离。用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。Figure 3-37. The separation of small molecules by paper chromatography. 样品点到层析虑纸的一端并且吹干，包含两个以上试剂的液滴可通过毛细管作用缓慢移动。 样品中的不同组分移动速率不同。2. Paper chromatography纸层析法又称纸色谱法 88将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。 Figure 3-38. The separation of molecules by column chromatography. 层析柱有玻璃和塑料柱两种，内填有可渗透的固体基质，如纤维素，而且基质也被溶剂浸润。样品放在柱子的最上端，然后大量的溶剂 从上端缓慢流过柱子，样品中不同的成分的迁移率不同，从而被分开，从柱子下端流入不同的试管。3. Column chromatographyFigure 3-39. Three types of matrices used for chromatography. 离子交换柱 (A) 是一种带有电荷的基质，它可保留带有相反电荷的分子，常用来分离蛋白质，通常所用基质为DEAE-cellulose,带正电 ；CM-cellulose and phosphocellulose, 带负电。凝胶过滤柱 (B) 的基质是惰性而多空的 。 比较小的分子因渗透到基质中而移动缓慢，较大的分子则从基质分子的空隙中较快的分离出来。亲和层析柱(C) 的基质分子上连接有一个特殊的配体，如抗体或酶基团 ，这些基团可以与特殊的分子结合，然后在洗脱下来。Figure 3-41. The detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) and the reducing agent beta-mercaptoethanol. These two chemicals are used to solubilize proteins for SDS polyacrylamide-gel electrophoresis. The SDS is shown here in its ionized form. 4. SDS polyacrylamide-gel electrophoresisFigure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).ElectrophoresisFigure 3-44. Separation of protein molecules by isoelectric focusing. At low pH the carboxylic acid groups of proteins tend to be uncharged ( -COOH) and their nitrogen-containing basic groups fully charged ( -NH3+), giving most proteins a net positive charge. At high pH the carboxylic acid groups are negatively charged (-COO-) and the basic groups tend to be uncharged ( -NH2), giving most proteins a net negative charge. At its isoelectric pHa protein has no net charge since the positive and negative charges balance. Thus, when a tube containing a fixed pH gradient is subjected to a strong electric field in the appropriate direction, each protein species present will migrate until it forms a sharp band at its isoelectric pH, as shown.等电点聚焦电泳Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. All the proteins in an E. coli bacterial cell are separated in this gel, in which each spot corresponds to a different polypeptide chain. Note that different proteins are present in very different amounts. The bacteria were fed with a mixture of radioisotope-labeled amino acids and the result was detected by auto-radiography. (Courtesy of Patrick OFarrell.) 第三节、生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术组织化学或细胞化学染色：是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 二、细胞组分的显示方法DNA的显示方法:1.甲基绿和毗罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，毗罗红使RNA呈现红色。2. Schiff反应： Schiff试剂即亚硫酸品红溶液，HO3S-C-(-C6H5-NH2)3 ，与细胞中的醛基（DNA或多糖）反应呈现红色。96甲基绿和毗罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，毗罗红使RNA呈现红色。利用甲基绿、毗罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。盐酸能够改变细胞膜的通透性，加速染色剂进人细胞，同时使染色体中的DNA与蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合。 DNA分子结构中带有醛基-CHO,用HCl水解可使醛基释放,再以无色的亚硫酸品红液(Schiff)染色使醛基与亚硫酸品红结合,呈现紫红色,这是DNA特有的显色反品红溶液通入二氧化硫得到的无色物质,又名希夫（Schiff）试剂,遇醛显红色,遇酮不变色,可以区别醛和酮 这是分子 HO3S-C-(-C6H5-NH2)3 RNA被酸水解后降解。97二、细胞组分的显示方法蛋白质的显示方法：用于蛋白质的定性和定位。1.米伦(Millon)反应显示酪氨酸的方法蛋白质上酪氨酸 + 氮汞试剂红色沉淀2.重氮反应 原理 芳香伯胺与亚硝酸作用,在酸性，低温下( 5)可生成重氮盐，即四氮盐。在碱性条件下，四氮盐与组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应形成有色复合物。 98四氮化联邻茴香胺法 (Tetra-azotized-o-anisidine) 应用 广泛应用于显示酶的活性 原理 芳香伯胺与亚硝酸作用,在低温下( 5)可生成重氮盐,此即重氮反应.重氮盐可与酚类作用生成有色化合物偶氮化合物.上述反应必须在酸性条件下进行.本实验,联邻茴香胺在酸性,低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色.因此,可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量. 二、细胞组分的显示方法多糖的显示方法： 高碘酸雪夫法(PAS法)： 原理 高碘酸为强氧化剂,它可以氧化多糖分子内1,2乙二醇(顺式和反式)而产生醛基,此醛基再与Schiff试剂结合即产生红紫色。99中性多糖糖原 碳水化合物 酸性多糖硫酸软骨素 A,B, C,肝素,硫酸角 (组织中多糖类) 质素,透明质酸等 蛋白多糖粘蛋白,唾酸粘蛋白 糖 脂脑苷脂类 组织中糖的种类较多,因此,要特异性地显示各种 糖类必须用抑制和酶水解来对照实验. 二、细胞组分的显示方法细胞内脂类染色：用易溶于脂类的染料,使之溶于所检的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂类着色。如：四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，苏丹与脂滴反应呈深红色。100二、细胞组分的显示方法细胞碱性磷酸酶： 底物：甘油磷酸酯 反应产物：磷酸根 再加入：铅盐或钴盐 产生：磷酸铅或磷酸钴无色沉淀 再加入：硫化铵 产生： 有色沉淀101102根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。（二）植物细胞培养外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。二、细胞融合同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。单克隆抗体技术正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。单克隆抗体技术主要作用用单克隆抗体代替多克隆抗体克服了交叉反应,提高了免疫学实验的特异性和敏感性,从而促进了医学检验学的发展;用单克隆作亲和柱,可分离提纯含量极低的可溶性的抗原,如激素,细胞因子和难以纯化的肿瘤抗原等，为物质提纯开辟了一条新途径；制备的单克隆抗体识别细胞表面特异性受体,若将抗肿瘤药物(如毒素或放射性物质)偶连到其上,构建生物导弹,有望攻克人类顽疾-肿瘤。单克隆抗体有广阔的发展前景,但有其局限性。单克隆抗体作为外源性的抗原，多次反复的注射后能促使机体发生免疫应答,产生相应的抗抗体,产生排斥现象，因此单克隆抗体应用于临床有其风险性，在紧急预防的情况下，可以慎用。 总之，单克隆抗体为人类在检验疾病、治疗疾病方面取得了重大突破,尽管它还有些弊端,相信在不久的将来人类会制备出更加优良的单克隆抗体,为攻克肿瘤作出更大的贡献! 第四节 模式生物模式生物的特点有:1)生理特征能够代表生物界的某一大类群；2)容易获得并易于在实验室内饲养繁殖；3)容易进行实验操作,特别是遗传学分析。1 海胆最早被使用的模式生物，主要用于早期发育生物学(受精，早期胚胎发育)。 1891年，HansDriesh在显微镜下把刚刚完成第一次卵裂的海胆胚胎一分为二，发现分开后的两个细胞各自形成了一个完整幼虫，证明了胚胎具有调整发育的能力。为现代发育生物学奠定了第一块观念里程碑。2 病毒基因组小，易于遗传操作，可作为外源基因载体。3 细菌 大肠杆菌培养简单易于操作，繁殖能力强，繁殖时间短等因素，常作为实验材料，在遗传学中主要作为遗传变异的物种，利用其变异来选取更好的材料，用在其他工业等方面如：发酵，菌体培养，医疗药物的提取等。大肠杆菌的存在，使得试验易于操作。4 酵母酿酒酵母特点:1)是单细胞生物,可在基本培养基上生长,可通过改变物理或化学环境完全控制其生长2)在单倍体和二倍体的状态下均可生长,并可在实验条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换,这对其基因功能的研究十分有利3)有将近31%编码蛋白质的基因或ORF与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性5 线虫Caenorhabditis elegans特点： 1) 通身透明，长不过1mm。2) 身体中所有细胞能被逐个盘点并各归其类。幼虫：556个体细胞，2个原始生殖细胞。成虫：雌雄同体成虫，959个体细胞，2000个生殖细胞。雄性成虫(偶见)：1031个体细胞，1000个生殖细胞。3) 生命周期短，从生到死仅为三天半，使得不间断地观察并追踪每个细胞的演变成为可能。4) 把线虫浸泡到含有核酸的溶液中可实现基因导入。6 果蝇drosophila melanogaster主要用于遗传和发育研究。其特点为：繁殖迅速，染色体巨大，易于进行基因定位。由14个体节构成的躯干完全对称，一套基因控制了这些体节从上到下的发生过程，这套基因普遍存在于从昆虫到人的基因组中，是决定机体左右对称布局形成的最基本因素。7 斑马鱼斑马鱼特点:1)产卵多，繁殖迅速。2)胚胎通体透明，是进行胚胎发育机理和基因组研究的好材料。8 小鼠17世纪开始用于解剖学和动物实验，经长期人工饲养选择培育，已育成千余个独立的远交群和近交系，是生物医学研究中广泛使用的模式生物，是当今世界上研究最详尽的哺乳类实验动物。1999年，美英几家大型科研机构成立了老鼠基因组测序的合作团体，2002年8月公布了老鼠基因组物理图谱的框架，完整的老鼠基因组图谱于2005年完成。模式生物小鼠的应用转基因小鼠与基因剔除小鼠小鼠突变品系与人类疾病研究 带有人生长激素基因的转基因小鼠（右侧小鼠为转基因小鼠，左侧为正常小鼠）。 130小鼠生理生化和发育过程和人类相似性，基因组的高度同源性以及的基因组改造技术的成熟性，均说明利用小鼠建立人类疾病的模型可以真实模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应。因