SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤ppt课件.ppt

实验十五 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 一 概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是蛋白质分析过程中最常用的技术 通常在电泳分离时 其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少 分子量大小和形态 但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS SDS将蛋白质的二硫键 氢键及梳水键打开 使蛋白质变性 SDS将包裹在变性蛋白表面 使蛋白质成为刚性分子 同时 由于SDS带有大量负电荷 使蛋白质本身带有的电荷可忽略 至此情况下 不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的SDS量 即蛋白质分子的大小 因此利用SDS PAGE可测定蛋白质的分子量 2 二 试剂 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液 Acr和Bis 称取丙烯酰胺30g 甲叉双丙烯酰胺0 8g 加水至100ml 过滤后存于棕色瓶中 于4 保存 4X分离胶缓冲液称取Tris18 17g 加入10 SDS贮备液4ml 用12mol LHCl调pH至8 8 定容至100ml 4X浓缩胶缓冲液称取Tris6 06g 加入10 SDS4ml 用l2mol LHCI调pH至6 8 定容至100ml 10 过硫酸铵称取过硫酸铵0 5g 加水至5ml 本储存液应现配现用 10X电极缓冲液称取Tris30g 甘氨酸144g 加入10 SDSl00ml 定容至1000ml 2X样品缓冲液称取蔗糖2g 或甘油2m1 加入10 SDS2ml 溴酚蓝0 25mg 浓缩胶缓冲液2 5ml 巯基乙醇0 5ml 加水定容至10ml 染色液称取考马斯亮蓝R 2502 5g 加入甲醇450ml 冰乙酸l00ml 水650ml 脱色液甲醇100ml 冰乙酸100ml 加水800m1 3 三 操作步骤 1 分离胶的制备 1 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度 制备不同浓度的凝胶所需的储备液可参考下表 该配方可配制0 75mm厚 10cmX7cm的凝胶 在配制凝胶时 将水 30 Acr和Bis储液 4X分离胶储液混合完全后 真空脱气5分钟 然后加入过硫酸胺和TEMED 立即准备灌制凝胶 2 将混合液充分混合后 缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中 注意在本操作过程中不能产生任何气泡 然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水 3 置于室温下15 30分钟 使凝胶聚合完全 在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线 除去上层水相 然后再用水或浓缩胶缓冲液 0 125mol m1Tris HCI pH6 8 0 1 SDS 洗凝胶表面 准备灌制浓缩胶 4 不同浓度凝胶的制备 5 2 浓缩胶制备的方法 1 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液0 6ml 浓缩胶缓冲液888u1 水2ml 10 过硫酸铵56ul TEMEDl0ul混合均匀后 立即灌胶 2 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中 然后将所需的样品梳 形成加样孔 插于夹心槽上部 并上下轻轻拉动梳子 小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡 待聚合完全后即可拔去梳子 准备电泳 6 3 样品制备及电泳 1 样品处理 蛋白质样品和分子量标准蛋白质在上样电泳前均需变性 通常是将样品蛋白质溶液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf管中 将混合物置于95 100 加热5分钟 立即置于冰上 或于 20 储存 以便再次分析时使用 2 上样 样品制备好以后 即可上样电泳 先将样品梳子移去 用双蒸水淋洗每个样品孔 然后在样品孔中加入电泳缓冲液 同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液 处理完毕后 根据实验的需要加样电泳 3 电泳 通常使用稳流的方式进行电泳 电流一般为18mA 时间大约3 4小时 7 4 凝胶的染色与脱色 电泳完毕后 倒去电泳缓冲液 取出夹心槽 小心地取出凝胶 置于染色液中染色4小时 并不时地轻轻晃动 染色完毕后 倒去染色液 用少量水淋洗凝胶 然后置于脱色液中脱色 并轻轻晃动 脱色至蓝色背景消失为止 此凝胶即可用于分析 考马斯亮蓝检测灵敏度为0 3 1ug 蛋