考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.doc

实验十四 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一、 目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、 材料、主要仪器和试剂1实验材料新鲜绿豆芽2主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000gmL的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85）四、操作步骤1标准曲线制作（1）0100gmL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作管 号1234561 000gmL标准蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（g）020406080100OD595nm（2）01 000gmL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01 000gmL的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作管 号7891011121 000gmL标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.000.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555蛋白质含量（g）02004006008001 000OD595nm2样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.51h以充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1号试管做空白。表3 待测液蛋白质浓度测定管 号1314蛋白质待测样品提取液（mL）0.10.950.10.95蒸馏水（mL）考马斯亮蓝G-250试剂（mL）OD595nm蛋白质含量（g）五、结果计算X提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（g / g鲜重）=测定时取样体积（mL）样品鲜重（g）式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。六、附 注1Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。七、思考题1制作标准曲线及测定样品时，为什