荧光定量实验报告(作业).doc

RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异一、实验目的 1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。二、实验原理实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green 的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法 ，SYBR Green I 是一种结合于所有 ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪 实验材料：MCF7细胞 实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒四、 实验步骤 4.1 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus）1) 将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA；2) 9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温（15-30）静置5分钟；3) 加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min；4) 12,000 g 4离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。5) 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。6) 向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。7) 12,000g 4离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。 8) 弃上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀浮起来，并静置3-5 min；9) 打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量(可以根据沉淀的多少确定）的RNase-free 水溶解沉淀。 测浓度，记录A260/280。4.2 1%琼脂糖凝胶电泳（取少部分进行跑电泳，留足够的量做反转录）4.3 反转录试剂体积（10l ）RNA500 ngGene specific primers(2M）RT primer1l5ReverseTranscriptase M-MLV Buffer2ldNTP (10mM)0.5lReverse Transcriptase M-MLV0.5lInhibitor (40 U/l)0.5lRNase-Free WaterUp to 10l反应条件：温度：42，45min;70，15min.4.4 qPCR试剂体积（20l ）2SYBR Green10lFP (10l)0.5lRP(10l)0.5lcDNA Template1lRNase-free Water8l反应程序：1） stage 1：预变性，95，3min;2） Stage 2:循环反应：40个循环 95，10s; 60，30s3）溶解曲线：95 ，15 s；60，1 min；95 ，15 s.五实验结果及分析5.1 RNA的质量检测结果ng/ul260/280260/230497.31.852.055.2 扩增曲线：5.3 溶解曲线：如图，为单一的峰，说明无非特异性产物，定量准确。5.4 实验结果及数据处理PCR 反应结束后，得到如下数据：Sample NameTarget NameReporterC C Mean MCF7miR21SYBR16.9795360616.97576142MCF7miR21SYBR16.97027779MCF7miR21SYBR16.9774704MCF7miR-130bSYBR22.8020000522.75579071MCF7miR-130bSYBR22.7244873MCF7miR-130bSYBR22.74088478MCF7GAPDHSYBR13.841777813.65600618 MCF7GAPDHSYBR13.54553699MCF7GAPDHSYBR13.58070374注：平行样的 Ct 值之间的差0.5 时表示重复性较好计算如下：CT(miR21)= 3.319755236CT(miR130b)= 9.099784533CT= CT(miR21)- CT(miR130b) =-3.319755236-9.099784533=-5.7800292972CT=2-(-5.780029297)= 0.0181985927miR21的表达量是miR130b的0.0181985927倍六问题与思考1.设计本次实验miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物？miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA F Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）引物Blast 结果：miR130b：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCCF Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）引物Blast 结果：2. 荧光定量PCR与普通PCR有什么异同点？原理不同：荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光；普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量，一般是紫外光。反应要求不同：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩