广东省江门市第一中学高中生物 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体同课异构课件2 新人教版选修3.ppt

2 2 2动物细胞融合与单克隆抗体 去壁 去壁 纤维素酶果胶酶 原生质体 植物细胞 原生质体融合 离心 振动 电刺激 聚乙二醇 再生细胞壁 杂种细胞 脱分化 愈伤组织 杂种植株 激素 筛选 等量 激素 再分化 植物体细胞杂交过程示意图 去壁的常用方法 原生质体融合方法 动物单个细胞的获得 动物细胞虽然没有细胞壁 但细胞间的连接方式多样而复杂 在进行有效的细胞融合之前 也必需获得单个分散的细胞 一 动物细胞融合 1 组织的获得 采用各种适宜的方法处死动物 取出组织块放入小烧杯中 用剪刀将组织块剪碎成1mm3大小 用吸管吸取hanks 平衡盐溶液之一 溶液冲下剪刀上的碎块 补加3 5ml的hanks溶液 用吸管轻轻吸打 低速离心 弃去上清液 留下组织块 2 组织的消化 通过生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞 根据不同的组织对象采用不同的酶消化液 如最常用的有胰蛋白酶和胶原酶等 其他的酶如链霉蛋白酶 粘蛋白酶 蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化 edta 乙二胺四乙酸 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性 edta用来螯合游离的镁离子和钙离子 以便保持抑制胰蛋白酶的活性 建议胰蛋白酶处理细胞前 用edta清洗细胞 以消除来自培养基中所有的二价离子 最适合消化传代细胞 常与胰蛋白酶使用 3 胶原酶消化 是一种由细菌中提取的酶 对胶原和细胞间质有较强的消化作用 适用于消化纤维组织 上皮组织 癌组织等 1 向培养瓶中放入1 5mm3大小的组织块 加5ml2000单位 ml的胶原酶干液 最终浓度为200单位 ml ph 6 5 2 36 5 水浴4 48小时 无需摇动 中间可更换酶液一次 3 当组织变软 分散于瓶底时 轻轻震荡即散成细胞团或单个细胞 小心倒出培养液 4 800r min离心5分钟 弃上清液 重新悬浮bss 缓冲平衡盐溶液 再离心一次 5 加入培养液制成细胞悬浮液 动物单个细胞的获得过程 思考下列问题 1 什么叫动物细胞融合 植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢 2 动植物细胞在结构上有何区别 这与它们杂交或融合过程有什么影响 3 动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同 两者的融合过程和方法是否也一样 一 动物细胞融合 一 动物融合的过程 p52 一 动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动 两个细胞正在融合 受精作用 2 动物融合的过程 p52 这是什么 动物细胞融合过程 有丝分裂 两个完整的杂交细胞 为什么用灭活的病毒作为诱导剂 先质融合 再核融合 只用单个的两种细胞来融合吗 灭活的病毒 灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用 使细胞互相凝聚 细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布 细胞膜打开 细胞发生融合 灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力 但并不破坏这些病原体的抗原结构 不灭活的病毒可以作为诱导剂吗 不可以 因为不灭活的病毒会感染细胞 不能诱导细胞的融合 3 细胞融合与融合诱导细胞融合物质 诱导剂 仙台病毒 聚乙二醇诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活 主要用于制备 单克隆抗体 获得杂种植株 主要用途 物理 化学方法 同左 灭活的病毒 物理 离心 振动 电激 化学 聚乙二醇 诱导方法 使细胞分散后诱 导细胞融合 去除细胞壁后诱 导原生质体融合 细胞融合的方法 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性 植物细胞全能性 细胞融合的原理 动物细胞融合 植物体细胞杂交 比较项目 4 植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较 细胞融合技术应用于哪些方面 细胞学 遗传学 免疫学及制备单克隆抗体 动物细胞融合有哪些方面的应用吗 利用动物细胞融合技术诱导形成杂交瘤细胞 在生产实际中杂交瘤细胞有怎样的应用 生产单克隆抗体 思考与讨论 1 抗体是由何种细胞产生的 效应b细胞 浆细胞 2 一个 淋巴细胞 浆细胞 能分泌多种抗体吗 每一个 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 3 一种抗原侵入机体之后 引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗 动物在免疫反应过程中 体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上 4 简述获得抗体的传统途径 抗原动物体抗体抗原不纯抗体不纯 二 单克隆抗体 刺激 浆细胞 1 抗原 概念 进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质 包括 蛋白质 多糖 核酸 病毒 细菌 各种细胞等 特点 外源性 结构性 分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点 特异性 抗原与抗体的反应 二 单克隆抗体 抗体是机体受抗原刺激后产生的 并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 抗体是由b淋巴细胞分化形成的浆细胞合成 分泌的 动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白 存在于血清中 本质是免疫球蛋白 2 什么是抗体 3 b淋巴细胞与抗体的关系 b淋巴细胞受抗原刺激后 可以产生抗体 动物体内的b淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体 每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体 mhc是种复合休 一种抗原的基因群 全称为主要组织相容性复合体 即指某一染色体上一群紧密连锁的基因群 人体内的五种抗体 要想获得大量的单一抗体 必须克隆单一的b淋巴细胞 形成细胞群 但是 在体外培养条件下 一个b淋巴细胞是不可能无限增殖的 怎样解决这个问题 为什么书上说动物体内可产生多达百万种以上的抗体 传统的抗体的生产方法及缺陷是什么 动物脾脏有上百万个b淋巴细胞系 一个细胞就是一个克隆 它针对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体 一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族 因此能刺激多个b淋巴细胞产生相应的单克隆抗体 因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物 称为多克隆抗体 4 单克隆抗体 概念 由单个b淋巴细胞经过无性繁殖 克隆 形成基因型相同的细胞群 这一细胞群所产生的化学性质单一 特异性强的抗体称为单克隆抗体 特点 特异性强 灵敏度高 如何大量生产单克隆抗体 p53 利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞 如何筛选 融合方式 杂种细胞的筛选 原理 两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞 筛选的目的是获得优良的杂种细胞 1 亲本2 同核体 同源原生质体的融合体3 异核体 非同源的原生质体的融合体4 多核体 含有双亲不同比例核物质的融合体5 异胞质体 具有不同胞质来源的杂合细胞 6 核质体 有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体 动物细胞的筛选方式 特定培养基 1 利用抗药性筛选系统 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞 2 营养互补筛选系统 细胞在缺乏一种或几种营养成分时 不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 3 温度敏感突变型杂种细胞的筛选 一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长 但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长 由此筛选杂种细胞 5 单克隆抗体的制备 动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合 淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选 有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白 这样的瘤细胞融合后 可能影响或降低所分泌抗体的滴度 所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型 能在体外无限繁殖和连续继代培养的骨髓瘤细胞 多用小鼠的骨髓瘤细胞 淋巴细胞 经过免疫处理的淋巴细胞 多用大鼠或小鼠 单克隆抗体制备过程 细胞融合 筛选 足够数量的 能产生特定抗体的细胞群 单克隆抗体 1 本过程利用了哪些原理 免疫原理 细胞融合原理和动物细胞培养原理 2 为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与b细胞融合 这样融合成的杂交瘤细胞 继承了双亲细胞的遗传物质 不仅具有b细胞分泌抗体的能力 而且还有无限增殖的本领 因而可以获得大量单克隆抗体 思考与讨论 6 单克隆抗体的应用 与常规抗体相比 单克隆抗体产量高 特异性强 灵敏度高 优越性十分明显 应用主要有 1 临床诊断 资料 目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体 许多缺乏良好诊断手段的传染病 免疫性疾病 血液病 内分泌疾病和遗传病 用单克隆抗体作为诊断手段 是一个必然趋势 另外 用单克隆抗体做体内诊断 借以鉴别和定位体内 病灶 也引起人们的注意 目前 主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断 1 单抗作为体内体外诊断试剂 现在已经有各种不同类型的单抗试剂在市场出售 例如乙型肝炎的表面抗原 铁蛋白 促绒毛膜性激素 促甲状腺激素 癌症 艾滋病等诊断试剂 用同位素标记的单抗在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤 心血管畸形的体内诊断 1 药物与单抗直接偶联这样的靶向制剂保留一定的药物活性 并具有一定的选择性 如 1 4 溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物 对肿瘤有明显的选择性毒性 2 作为载体 运载抗癌药物 形成 生物导弹 治疗肿瘤 2 药物通过小分子与单抗连接单抗通过一些小分子交联剂 把药物分子上的某些基团连接起来 这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后 会进入溶酶体 在酸性环境下释放药物 而杀死肿瘤细胞 3 药物通过大分子与抗体相连大分子聚合物 葡聚糖 多聚赖氨酸 多聚谷氨酸 聚合多肽和血清蛋白等 总之 利用单抗试剂合可以作为靶向药物 针对肿瘤 自身免疫系统疾病 各种病原体病等 3 杂交人 鼠单克隆抗体 鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统 还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应 嵌合抗体可以保留其目标专一性 降低人的抗鼠反应 小结 两个过程 动物细胞培养过程 单克隆抗体制备过程 三个 一 一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒 一个新细胞 杂交瘤细胞 一个优势 单克隆抗体特异性强 灵敏度高的优势 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法 设计的生产破伤风杆菌的实验方案 制备单克隆抗体 b细胞 抗体 细胞融合 灭活病毒 双亲细胞 分泌抗体 无限增殖 原代 传代 50 1 动物细胞工程技术的基础是 a 动物细胞融合b 胚胎移植c 动物细胞培养d 核移植 在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中 正确的是 a 结果是相同的b 杂种细胞的形成过程基本相同c 操作过程中酶的作用相同d 诱导融合的手段相同 单克隆抗体制备过程中 骨髓瘤细胞和b淋巴细胞诱导融合后 要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 b淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞a b c d c 课后习题 2 动物细胞融合和植物原生质融合决定于 a 细胞膜的流动性b 细胞膜的选择透过性c 细胞质的流动性d 细胞质酶的活性 a 一 选择题 3 生物导弹 是指 a 单克隆抗体b 杂交瘤细胞c 产生特定抗体的b淋巴细胞d 在单克隆抗体上连接抗癌药物 d 4 只能使动物细胞融合的常用诱导方 a pegb 灭活的病毒c 电刺激d 离心 b 二 简答题 1 淋巴细胞是由动物体 中的 细胞分化发育而来的 2 杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖 氨基酸的主要方式是 骨髓 造血干 主动运输 1 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同 2 制备单克隆抗体时 为什么要选用b淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞 提示 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同 不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁 然后再融合 动物细胞融合是两个体细胞直接融合 提示 哺乳动物感染抗原后 其体内会形成相应的b淋巴细胞 b淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原 动物在免疫反应的过程中 每一种b淋巴细胞能分泌一种特异性抗体 要想获得大量的特异性抗体 必须使能分泌该单一抗体的b淋巴细胞大量增殖 b淋巴