心肌细胞及心肌组织RT-PCR protocol by Ps.doc

心肌细胞及心肌组织RT-PCR实验方案2代CFbs（心肌成纤维细胞，40ml培养瓶内，瓶底面积约25mm）换无血清培养基一天，镜下见细胞几乎呈融合状态。实验准备：实验前两天开始：浸泡1.DEPC 用纯水按0.1%浓度配制 ，1.1升（1升浸泡，100ml配酒精）2.Tip 10L 200L 1ml （多多益善，尤其是10L tip）3.EP Tube （1.5ml）（多多益善，尤其是需要分装试剂时）4.PCR Tube（200L或500L）（视情况定） 5 电泳槽高温烘烤（160度5个小时）三个饭盒（分别装大枪头，中小枪头，EP管）三个玻璃瓶（分装异丙醇，氯仿和乙醇）电泳用1.Agarose 2.Golden View 3.DNA Marker4.上样缓冲液0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6缓冲液，4保存5.电泳缓冲液Tris 54g 硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml5TBE （贮存液）再将5TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水500ml工作缓冲液其他：PE手套 实验前一天需要准备：一，引物的配制：1. 将所合成的目的基因和内参上下游引物(1OD)用0.1% DEPC水溶解。2. 根据各个引物分子量的不同，计算加0.1%DEPC水的量，使其终浓度均为20pmol/l。质量数（g）=OD值*33分子量=碱基数*324.5摩尔数（nm）=质量数/分子量加入水量（l）=摩尔数（nm）*1000/203. 每条2 OD的引物一般可获得0.5mL左右的终容积，所以最好分装后于-20冰箱中冻存，放置反复冻融。二，预先混合以下试剂：注：中数字为Takara试剂盒中编号。11MgCl2 20L810RT Buffer 10L5RNase Free Water 37.5 L10dNTP 10L以上组成Mix液77.5L三，阳性对照RNA易降解，置于-80冰箱中保存。另外，一些蛋白试剂，如酶，需要分装，避免反复冻融。实验当天需要准备：开机预热紫外分光光度计、PCR仪、水浴箱（60）。注意适时将试剂从冰箱中取出，溶解。RNA提取1. 每孔加入3mlPBS，冲洗2遍，直至洗净培养基。（如果心肌细胞生长在40ml培养瓶中，则以下所加试剂均需乘以2.5）2. 加TRIzol每孔1ml。3. 轻柔的用移液枪吹打几次。4. 吸取样品到一个1.5ml EP管中5. 室温放置5分钟。6. 加入0.2ml氯仿（chloroform）。7. 用手剧烈震荡ep管15秒，充分混匀。8. 12000转4离心10分钟。（可利用三次离心时间配做电泳胶）。9. 仔细转移上层水相到一个新EP管中，注意千万不能贪多，把中间相和有机相吸入。10. 加0.5ml异丙醇（isopropyl alcohol）11. 室温放置10分钟。12. 12000转4离心10分钟。13. 去上清，加1ml乙醇。14. 震荡混匀。15. 7500转4离心5分钟。16. 去上清，简单通风5-10分钟干燥RNA。（不能太干，肉眼不能明显看到水分即可）17. 加50L无RNAase水，吹打数次。18. 55-60水浴10分钟。19. 下一步实验或冷冻保存。此时可以取出RT-PCR的试剂盒，准备解冻。RNA的纯度和浓度检测1) 预热紫外分光光度计（进口那台）。使用应用程序中的A260/A280，ssDNA/RNA程序。2) 用灭活的DEPC水1000l调零。3) 取RNA样品1l，加入灭活的DEPC水1000 l，混匀。（如果RNA浓度过稀，则可适当减少稀释倍数，改用微量比色杯。）4) 直接读取RNA浓度和Ratio，并根据稀释情况得出实际的RNA浓度，重复操作三次取平均值。5) RNA的Ratio均在1.7-2.0之间。RNA浓度在0.5g/l-1g/l，分装10l一管，于-70冰箱中冻存。RNA完整性的检测1) 制备琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶0.4g，加入0.5TBE缓冲液40ml，微波炉加热至熔化。2) 最后配成终浓度为1%琼脂糖凝胶液体。3) 加入Golden View 2l，混匀。4) 冷却至室温。5) 在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入0.5TBE缓冲液中，除去样本梳。6) 取1gRNA与1.5l甲醛、4.5l甲酰胺混合，加入1l上样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40%蔗糖)，75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3处。RT-PCR产物电泳分析1. 取10l RT-PCR产物与2l上样缓冲液混合后上样于1%琼脂糖凝胶，同时以20l Ladder点样，以0.5TBE为缓冲液电泳。2. 70V电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。3. 图像分析处理系统进行辉度扫描，并以内参校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。PCR产物测序：扩增好的目的基因的PCR产物(50l)进行测序。RT-PCR：注：中数字为Takara试剂盒中编号。1，取出一个200LPCR反应管，顺次加入以下成分：MMix液 7.75L2RNase Inhibitor 0.25L1AMV 0.5L3Random 9mers 0.5L RNA样品 1L以上为RT反应体系共10L2，将反应管置入PCR仪中，按以下设置参数进行逆转录反应：（我已经预设黑PCR仪中Ps-RT1-1程序）30 10min45 30min99 5min5 5min（1 cycle）3，上述逆转录过程完成之后，将此管中另加入以下成分：95*PCR buffer 10L5RNase Free Water 28.75L6Takara Taq 0.25L上游引物 0.5L下游引物 0.5L4重新放入PCR仪中按一下方案进行：（本实验方案为ECE-1，其他样品则灵活变通）94 2min94 30sec45/51 梯度 40sec40 cycles72 30sec72 7min阳性RNA对照RT部分：MMix液 7.75L2RNase Inhibitor 0.25L1AMV 0.5L3Random 9mers 0.5L14positive control RNA 1L30 10min45 30min99 5min5 5min（1 cycle）PCR部分：95*PCR bu